高效液相色谱-串联质谱法同时测定盐酸拉贝洛尔中三种杂质

郝丽娟，苗会娟，韩佳芮，徐欢欢，王茉莉，徐艳梅

（1.河北省药品医疗器械检验研究院，国家药品监督管理局仿制药质量控制与评价重点实验室，石家庄 050227；2.河北科技大学，石家庄 050091）

盐酸拉贝洛尔用于治疗高血压和心绞痛等疾病，具有α1受体和β受体双重拮抗作用，因不能突破胎盘屏障，不进入母胎循环，临床上多用于治疗妊娠高血压[1-4]。为了保障公众尤其是妇婴重点人群的用药安全，对于盐酸拉贝洛尔中微量和痕量杂质的测定非常必要。

我国药典、美国药典和日本药典均未设置盐酸拉贝洛尔有关物质检查项[5-7]；英国药典2020版采用薄层色谱(TLC)法测定有关物质[8]，分离度和准确度均不佳；周怡等[9]和郑金琪等[10]采用高效液相色谱(HPLC)法测定盐酸拉贝洛尔药物中有关物质，只对单一杂质和杂质总量进行了检测；郝丽娟等[11]采用HPLC 法同时测定盐酸拉贝洛尔片中三种杂质，但灵敏度较低，且以上方法均不能实现痕量杂质的检测。高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法可以实现微量和痕量物质的精准检测，而且对各杂质之间的色谱分离度无严格要求，但目前未见HPLCMS/MS 法应用于盐酸拉贝洛尔杂质测定的报道。欧洲药典指出盐酸拉贝洛尔在合成和存储过程中可能产生的微量或痕量杂质主要有7 种，其中杂质A是最易产生的降解杂质，是酸性条件下盐酸拉贝洛尔分子中的酰胺键水解为羧酸而产生，杂质B 是酰胺键水解后再酯化产生，杂质F是工艺杂质，三者均需要得到有效控制。笔者参照文献[12-16]建立了灵敏度高、专属性好的HPLC-MS/MS 法，实现了对盐酸拉贝洛尔中2-羟基-5-[1-羟基-2-[(1-甲基-3-苯丙基)氨基]乙基]苯甲酸(以下简称“杂质A”)、2-羟基-5-[1-羟基-2-[(1-甲基-3-苯丙基)氨基]乙基]苯甲酸甲酯(以下简称“杂质B”)和2-羟基-5-(2-(4-苯基丁-2-氨基)乙酰)苯甲酰胺(以下简称“杂质F”)三种杂质的同时测定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱-质谱联用仪：Sciex QTRAP6500型，美国AB公司。

电子天平：XS105型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

盐酸拉贝洛尔对照品：质量分数为99.8%，批号为1744-096 A1，美国TLC公司。

杂质A 对照品：质量分数为98.1%，批号为2228-052 A3，美国TLC公司。

杂质B 对照品：质量分数为99.6%，批号为2148-016 A3，美国TLC公司。

杂质F (拉贝洛尔酮)：质量分数为100%，批号为008-190403，某药厂。

盐酸拉贝洛尔样品：某药厂原料药。

甲醇：色谱纯，德国默克公司。

乙酸：色谱纯，上海麦克林生化科技股份有限公司。

实验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司)；流动相：A相为0.1% (质量分数，下同)的乙酸溶液，B相为乙腈-0.1%的乙酸溶液(体积比为1∶1)，流量为1.5 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，0～5 min时，流动相A体积分数为100%，5～40 min 时，由100%逐渐减小到0，40～45 min 时，由0 逐渐增加到100%；检测波长：230 nm；柱温：40 ℃；进样体积：10 μL。

1.2.2 质谱条件

离子源：大气压化学电离源，正离子模式；监测模式：MRM，盐酸拉贝洛尔及3 种杂质的多反应监测质谱参数见表1；离子源温度：350 ℃；脱溶剂气流量：35 mL/min；气帘气压力：0.103 MPa；喷雾电压：5 500 V；喷雾气压力：0.241 MPa；干燥气压力：0.241 MPa。

表1 盐酸拉贝洛尔及3种杂质的多反应监测质谱参数

1.3 样品处理

精密称取盐酸拉贝洛尔样品100 mg，置于10 mL容量瓶中，加入流动相A适量，振摇，溶解后用流动相A稀释至标线，即得样品溶液。

1.4 溶液配制

标准溶液：精密称取杂质A、杂质B对照品和杂质F 各约10 mg，分别置于10 mL 容量瓶中，加入流动相A溶解并定容至标线，摇匀。

混合标准溶液：分别精密量取上述3 种标准溶液各1 mL，置于同一只100 mL容量瓶中，加入流动相A 稀释至标线，摇匀；再精密量取1 mL，置于25 mL容量瓶中，加入流动相A稀释至标线，摇匀，即得杂质A、B、F质量浓度均约为400 ng/mL的混合标准溶液。

系列混合标准工作溶液：精密量取混合标准溶液0.025、0.05、0.125、0.25、0.50、1.25、2.50、5.25 mL分别置于10 mL 容量瓶中，用流动相A 作溶剂稀释至标线，摇匀，得杂质A、杂质B、杂质F 的质量浓度均分别为1、2、5、10、20、50、100、210 ng/mL 的系列混合标准工作溶液。

加标样品溶液：精密称取盐酸拉贝洛尔样品100 mg，置于10 mL 容量瓶中，加入流动相A 适量，振摇，溶解后精密加入混合标准溶液0.5 mL，用流动相A稀释至标线，摇匀。

1.5 实验步骤

分别取系列混合标准工作溶液、空白溶液和样品溶液，注入液相色谱-质谱仪中测定，记录色谱图。分别以各杂质质量浓度(x)为横坐标、色谱峰面积(y)为纵坐标进行线性回归分析，按标准曲线法计算各杂质含量。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

2.1.1 色谱方法

TLC 法测定有关物质时，易受干扰，准确度差。HPLC 法专属性和准确度明显优于TLC 法，但无法实现痕量物质的检测。HPLC-MS/MS 法多应用于检测微量和痕量物质，而且只要主成分和各杂质可以实现有效分离即可实现各杂质的准确检测，对各杂质之间的分离度无严格要求，因此HPLC-MS/MS法可满足同时测定3种痕量杂质的要求。

2.1.2 色谱柱

盐酸拉贝洛尔与杂质A 和杂质F 的极性相近，要求色谱柱分离效能较高，可以将盐酸拉贝洛尔与各杂质有效分离，同时为了防止色谱柱过载而导致待测物流失，还要求色谱柱具有较大的载样量。分别考察了AgelaVenusil MP C18柱[250 mm×4.6 mm，5 µm，安捷伦科技(中国)有限公司]、Agilent Eclipse XDB-C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，安 捷 伦 科 技( 中 国) 有 限 公 司] 和ACE EXCEL3 C18-AR 柱(150 mm×4.6 mm，3 µm，英国ACE 公司) 3 种不同型号的色谱柱。结果发现，3种色谱柱均能实现主成分与杂质的有效分离，其中AgelaVenusil MP C18柱分离色谱峰出现拖尾，Agilent Eclipse XDB-C18柱分离的色谱峰形和分离效果最好，可以满足测定要求，故选择Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱。

2.1.3 流动相

质谱法中常加入少量的酸类来提高离子化效率，改善分离效果。流动相中加入酸类可以使样品中含有活泼氢的易解离组分分离效果更好，改善色谱峰拖尾，优化色谱峰型，常用的酸为甲酸或乙酸。分别采用甲酸、乙酸配制流动相，均可以得到较好的分离效果，采用甲酸时容易产生峰展宽，故选择乙酸配制流动相。

以0.1%乙酸溶液为流动相A，分别考察乙腈-0.1%乙酸溶液、甲醇-0.1%乙酸溶液为流动相B时目标物的分离效果。结果表明，以乙腈-0.1%乙酸溶液为流动相B 时待测物更易洗脱，且乙腈的洗脱效应强于甲醇，因此选择流动相B 为乙腈-0.1%乙酸溶液。

2.2 质谱条件优化

2.2.1 离子源

在选择离子源时，分别对3 种杂质在电喷雾离子源(ESI)和大气压化学电离离子源(APCI)的响应进行了考察。结果表明，3种杂质在APCI源上优化后均具有较强的响应，且响应强度均约为ESI源的2倍，故以APCI源作为离子源。

2.2.2 进样阀切换

根据3 种杂质的特性，对其进行分离优化。盐酸拉贝洛尔极性较大，最快出峰(相对保留时间约19 min)，故将20 min 前调整进样阀切入废液，以防止高浓度的主成分进入质谱仪对仪器的污染。

2.3 专属性

分别取混合标准溶液、空白溶液和样品溶液，注入液相色谱-质谱仪，记录色谱图，所得总离子流(TIC)色谱图如图1所示。

图1 混合标准溶液、空白溶液及加标样品溶液TIC图

2.4 线性方程与检出限

分别精密量取系列混合标准工作溶液，按1.2仪器工作条件测定，分别以3 种杂质的质量浓度(x)为横坐标、色谱峰面积(y)为纵坐标进行线性回归分析，计算线性方程及相关系数。

精密量取各组分质量浓度均为1 ng/mL的混合标准工作溶液，以流动相A 为溶剂逐级稀释，按1.2仪器工作条件测定，以3 倍信噪比(S/N)对应的质量浓度作为检出限，以10倍信噪比(S/N)对应的质量浓度作为定量限。

3种杂质的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限结果见表2。由表2可知，3种化合物的质量浓度分别在1.016 0～203.20、1.032 0～206.40、1.037 0～207.40 ng/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.999；3种化合物的检出限均为0.03 ng/mL，定量限均为0.10 ng/mL。

表2 质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.5 溶液稳定性

取3种杂质的质量浓度均为20 ng/mL的混合标准溶液和加标样品溶液，于室温下分别放置0、1、2、3、4、5、10 h，精密量取不同放置时间的上述溶液，按1.2仪器工作条件测定，结果见表3。由表3可知，混合标准溶液中杂质A、杂质B 和杂质F 色谱峰面积的相对标准偏差分别为2.7%、1.2%和3.5%，加标样品溶液中杂质A、杂质B 和杂质F 色谱峰面积的相对标准偏差分别为1.2%、4.1%和3.1%，表明混合标准溶液与加标样品溶液均在10 h内稳定。

表3 混合标准溶液和样品溶液不同放置时间时的色谱峰面积

2.6 加标回收与精密度试验

精密称取盐酸拉贝洛尔原料约100 mg，平行称取9 份，置于10 mL 容量瓶中，加入2 mL 流动相A，振摇使溶解，再分别精密加入3 种杂质混合标准溶液0.4、0.5、0.6 mL 各3 份，用流动相A 定容至标线，摇匀。按1.2仪器工作条件测定，计算加标回收率和测定结果的相对标准偏差，结果见表4。由表4 可知，杂质A、杂质B、杂质F 的平均回收率分别为95.3%、92.4%、91.9%，相对标准偏差分别为1.44%、1.46%、1.11%，表明该法具有较高的准确度和精密度，可准确地测定盐酸拉贝洛尔中的杂质含量。

表4 加标回收与精密度试验结果

3 结语

建立了同时测定盐酸拉贝洛尔中的杂质A、杂质B、杂质F的高效液相色谱-串联质谱法。该方法准确度高，灵敏度好，对分离效果的要求较低，简便快速，相对于HPLC法检测限更低，可用于同时测定盐酸拉贝洛尔中的3 种杂质，为更好地控制盐酸拉贝洛尔的质量提供了一种新方法。