高效液相色谱-管碟法联合分析牛黄解毒片中抑菌物质黄芩苷、甘草苷

张伟

（淮安市食品药品检验所，江苏淮安 223300）

中医药是我国的民族瑰宝和独特的医疗卫生资源，具有丰富完善的理论体系和天人合一的哲学内涵，尤其在近年的疫情中发挥着中流砥柱的作用[1]。然而，鉴于中药处方药材多、成分复杂等原因，中药中发挥药效成分的物质基础一直模糊不清，这已成为中药现代化与国际化发展道路上的瓶颈[2]。近年来，中药功效成分研究的理念不断创新，研究的技术日趋成熟，并涌现出很多的研究成果，诸如王静等[3]对枸杞功效成分研究，冯敬骞等[4]对衢枳壳功效成分研究，贾传青等[5]对条芩与枯芩的功效成分研究，以及刘久石等[6]对藁本类药材功效成分研究等。而牛黄解毒片的功效成分研究成果尚未见报道。

牛黄解毒片处方中有8味药材[7]，甘草和黄芩是重要的两味药材。唐金蓉等[8]对黄芩和刘秀丽等[9]对甘草研究可知，黄芩与甘草均具有抑菌功效，但研究人员未对其抑菌成分进一步研究。而在检查微生物限度时，亦发现牛黄解毒片具有抑菌效果，尤其是对金黄色葡萄球菌有较强抑制作用。鲁倩等[10]研究发现黄芩中野黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素等具有抑菌作用；韩维维等[11]研究发现甘草中黄酮类化合物具有抑菌作用。笔者以黄芩和甘草中的黄酮类化合物黄芩苷、甘草苷为目标抑菌物质，运用高效液相色谱(HPLC)法对牛黄解毒片中的物质进行有效分离，然后用管碟法测定出牛黄解毒片的抑菌活性，最后借助指纹图谱与灰色关联度[12]分析方法，对12批不同厂家的牛黄解毒片中黄芩苷、甘草苷两种抑菌成分进行分析测定，不仅证明了牛黄解毒片中的黄芩与甘草两味药材具有抑菌作用，而且进一步得出黄芩苷与甘草苷是牛黄解毒片中的两种抑菌成分；同时，与试管二倍稀释法和K-B 纸片法[13]相比，管碟法还可以直观反映出牛黄解毒片的抑菌效果。该方法可为牛黄解毒片的功效成分研究提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Waters2695/2489 型，美国Waters公司。

电 子 天 平：(1)XP6 型，感 量 为0.01 mg；(2)XS205型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

数控超声波清洗器：KH7200DE型，昆山禾创超声仪器有限公司。

立式压力蒸汽灭菌锅：YXQ-LS-75SLL 型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

生化培养箱：SPX-300-Ⅱ型，上海跃进医疗器械有限公司。

电热恒温鼓风干燥箱：G2X-GF101-3BS 型，上海跃进医疗器械有限公司。

多功能微生物自动测量分析仪：ZY-300IV 型，北京先驱威锋技术开发公司。

甘草苷、黄芩苷对照品：批号分别为111610-201607、110715-201821，质量分数分别为93.1%、95.4%，中国食品药品检定研究院。

金黄色葡萄球菌：编号为CMCC(B) 26003，江苏省食品药品监督检验研究院。

牛黄解毒片样品：12 批，编号分别为S1～S12，分别来自12个不同的生产厂家。

阿莫西林胶囊样品：1批，市售。

甲醇、乙腈：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。

磷酸：分析纯，上海久亿化学试剂有限公司。

磷酸氢二钾、磷酸二氢钾：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

培养基：平板计数与抗生素检定专用Ⅰ号，广东环凯微生物科技有限公司。

实验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 HPLC法

色谱柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，北京迪科马科技有限公司)；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm[14]；进样体积：10 μL；流动相：以质量分数为0.15%的磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，流量为1.0 mL/min，按表1 程序进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2 管碟法

将培养皿置于37.0 ℃培养箱中培养24 h。

1.3 溶液制备

1.3.1 HPLC法

样品溶液A：取牛黄解毒片10片(包衣片除去包衣)，研细，取约2.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入水50 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率为400 W，频率为40 kHz) 30 min，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

黄芩苷、甘草苷对照品溶液：分别取黄芩苷对照品、甘草苷对照品约1 mg，精密称定，分别置于10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至标线，摇匀，即得。

1.3.2 管碟法

样品溶液B：取牛黄解毒片(包衣片除去包衣)适量，研细，取约2.5 g，精密称定，置于25 mL 容量瓶中，加入经灭菌处理的磷酸盐缓冲液(pH 7.8)适量，溶解，超声处理(功率为400 W，频率40 kHz) 30 min，放冷，加入经灭菌处理的磷酸盐缓冲液(pH 7.8)至标线，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

阿莫西林对照溶液：取阿莫西林胶囊内容物适量，研匀，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加入灭菌水溶解并稀释至标线，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL，置于200 mL 容量瓶中，加入经灭菌处理的磷酸盐缓冲液(pH 7.8)稀释至标线，摇匀，即得。

1.4 实验步骤

首先用高效液相色谱法建立牛黄解毒片的指纹图谱，获取牛黄解毒片中化学成分信息；然后用管碟法对牛黄解毒片进行抑菌性分析，获取牛黄解毒片的功效信息；最后运用灰色关联度法将牛黄解毒片中的化学信息与功效信息联系起来分析出其中的抑菌性成分。

2 结果与讨论

2.1 HPLC法

2.1.1 实验条件优化

参考文献[14]，分别设定检测波长为237、260、280 nm，利用色谱峰测定牛黄解毒片，结果显示在280 nm波长下黄芩苷的响应值最大，其色谱峰面积是237 nm 波长条件下峰面积的2.74 倍，是260 nm波长条件下黄芩苷峰面积的1.80 倍，故选择检测波长为280 nm。

对牛黄解毒片的提取时间进行优化，分别将样品超声处理30、40、50、60 min。结果表明，黄芩苷色谱峰面积在30 min时达到最大，故选择超声处理30 min的提取方法。

2.1.2 重现性试验

取编号为S4 样品，平行制备6 份供试品溶液，分别进样测定，记录色谱图，结果见表2。由表2 可知，黄芩苷与甘草苷保留时间测定结果的相对标准偏差分别为0.7%和0.9%，色谱峰面积测定结果的相对标准偏差分别为0.6%和0.9%，表明方法重现性良好。

表2 重现性试验结果

2.1.3 稳定性试验

取样品溶液A，分别于室温下放置0、2、6、12、18、20、24 h 进样测定，记录色谱图。黄芩苷与甘草苷的色谱峰面积测量数据列于表3。由表3可知，甘草苷与黄芩苷色谱峰面积测定结果的相对标准偏差分别为1.8%、1.3%，表明样品溶液A 在室温下放置24 h内稳定性良好。

表3 稳定性试验结果

2.1.4 指纹图谱的建立与相似度评价

取编号分别为S1～S12 的牛黄解毒片样品，按照1.3.1样品溶液A制备方法制备样品溶液，然后分别进样测定，记录色谱图。选取S12 样品的色谱图作为对照指纹图谱(R)，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012 年版)建立指纹图谱(见图1)，并进行相似度评价。结果显示，与对照指纹图谱相比，12 个厂家的牛黄解毒片HPLC 图谱整体峰形一致，相似度均不低于0.937 (见表4)。表明不同厂家的牛黄解毒片成分差异较小，具有较好的一致性。

图1 12批牛黄解毒片HPLC指纹图谱

表4 12批牛黄解毒片相似度评价结果

2.1.5 共有峰指认与相对峰面积

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012年版)软件，设置时间窗口为0.1 min，选择指纹图谱中峰形较好的色谱峰进行多点校正，采用中位数法生成图谱，同时结合对照品的HPLC图谱，指认出1#共有峰为甘草苷，2#共有峰为黄芩苷(见图2)。

图2 牛黄解毒片、黄芩苷对照品、甘草苷对照品液相色谱图

采用Waters2695/2489 高效液相色谱仪数据处理软件对2 个共有峰进行积分，计算各个峰相对色谱峰面积(色谱峰面积/取样质量)，结果见表5。

2.2 管碟法

2.2.1 细菌培养与计数

取第Ⅱ代金黄色葡萄球菌放置至室温，移至生物安全柜中，用接种环取适量至10 mL 的生理盐水试管中，用生理盐水稀释至10 倍体积，取稀释液1 mL 至平皿中，加入20 mL 新鲜的平板计数培养基，凝固后移至生化培养箱中于32 ℃培养3 d，计数，菌液浓度为2.7×107cfu/mL。

2.2.2 抑菌试验

取灭菌的抗生素鉴定用培养基Ⅰ号200 mL，加入0.12 mL的第Ⅱ代金黄色葡萄球菌菌液，混匀，取20 mL加入平皿中，冷却凝固，在培养基表面放置牛津杯。分别向牛津杯中加入样品溶液B与阿莫西林对照溶液，置于培养箱中于37.0 ℃培养24 h[15-16]。抑菌效果如图3所示。

采用抑菌圈扫描仪，测定抑菌圈直径，按照式(1)计算相对抑菌活性：

式中：RA——样品的相对抑菌活性；

Ax——样品的抑菌圈面积；

ms——阿莫西林对照品质量；

mx——样品质量；

As——阿莫西林对照品的抑菌圈面积。

12批样品相对抑菌活性计算结果见表6。

表6 12批牛黄解毒片抑菌作用测定结果

2.3 灰色关联度分析

参考文献[17]、[18]，采用均值法处理表5与表6的原始数据，对各个数据归一化。将变换后的相对抑菌活性数据记为参考数列Y(k)，其中k=1，2，3……n，指纹图谱黄芩苷与甘草苷峰相对峰面积记为比较数列Xi(k)，其中i=1，2，3……n，则绝对差计算公式为△i(k)=|Y(k)-Xi(k)|，i表示指纹图谱中共有峰编号(i=1，2，3……n)；关联系数按式(2)计算：

式中：ρ——分辨系数，ρ=0.5。

计算12 批样品中黄芩苷与甘草苷色谱峰的关联系数，12 批样品关联系数的平均值作为关联度，结果列于表7。由表7可知，黄芩苷与甘草苷的关联度均大于0.6，表明两组分与抑菌活性有关联性[19]。

表7 2个共有峰关联系数与关联度结果

3 结语

采用高效液相色谱法和管碟法对牛黄解毒片中的抑菌性功效成分进行定性检测，通过灰色关联度法将牛黄解毒片中的化学物质信息与功效信息关联分析，科学准确地分析出牛黄解毒片中2 种抑菌性化学物质——黄芩苷和甘草苷。该方法以水为提取溶剂，更接近牛黄解毒片在人体中发挥抑菌作用的环境，所提取的物质亦类似于人体中发挥药效的物质成分。但由于水为极性溶剂，一些非水溶性成分如黄芩素无法提取分离，也未能考察其抑菌活性。该法简便、直观、科学、准确，可以为牛黄解毒片功效成分研究以及具有抑菌功效的中药研究提供方法参考。