超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法快速鉴定甘舒诺丹胶囊化学成分

崔雪洁，许先梅，许震，钱志刚，荣梅芬，卓茵，杜茂波

（1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700； 2.芜湖市诺康生物科技有限公司，安徽芜湖 241000）

甘舒诺丹灵芝孢子粉葛根丹参黄芪胶囊(以下简称甘舒诺丹胶囊)是由灵芝孢子粉、葛根、丹参和黄芪4味中药提取物组成的具有辅助保护化学性肝损伤或酒精性肝损伤作用的保健食品。方中灵芝补虚强壮、扶正固本，自古以来就被用于补肝益气，与灵芝的成分相比，灵芝孢子粉中的腺嘌呤核苷、蛋白质以及微量元素等更为丰富[1]。葛根可用作解酒及酒醉不醒的治疗[2]。黄芪和丹参早在《神农本草经》中就有记载，是补气活血治疗气虚血瘀证的典型药对，且疗效确切，常被用作肝损伤的治疗[3]。目前，尚缺乏关于甘舒诺丹胶囊内容物的快速检测和成分鉴定方法。为了控制甘舒诺丹胶囊的产品质量，便于将本保健品进一步申报为药品，笔者采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF/MS)联用技术，结合自建数据库的筛查，通过对比相对分子质量、碎片离子信息以及裂解规律等方式，对甘舒诺丹胶囊中的主要化学成分进行定性鉴定并对检测到的化合物所属药材进行了归属，以期为后续临床应用、质量控制以及新药研究提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：Waters ACQUITY UPLCTM型，美国沃特世公司。

质谱仪：Waters Xevo G2-XS Qtof 型，美国沃特世公司。

电子天平：AT201型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

离心机：Legeno Micro 21R型，美国赛默飞世尔公司。

数控超声波清洗器：KQ-250DE型，昆山市超声仪器有限公司。

甘舒诺丹胶囊样品：0.45 g/粒，国食健注G20110335，批号为210320，上海奥诺康生物科技有限公司。

乙腈、甲醇：质谱纯，德国默克公司。

甲酸：质谱纯，美国西格玛奥德里奇公司。

实验用水为超纯水。

将冷冻的胰脏置于4℃冰箱中解冻，待样品将要完全解冻时从头、体、尾三个部位剪取约0.5 g左右的胰腺，并用分析天平准确称重。按质量体积比1∶9的比例加入匀浆介质在玻璃匀浆器中匀浆(整个操作过程都在冰浴条件下进行)。充分匀浆后将匀浆液倒入离心管中3 000 r/min 4℃条件下离心10 min，收集上清并迅速将上清液分装成若干份贮存于-20℃中，以备进行酶活性分析。

1.2 样品溶液制备

取甘舒诺丹胶囊内容物粉末约1 g，精密称定，置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇20 mL，以60 kHz超声30 min，冷却，用超纯水补足损失的质量，过滤，取续滤液，离心，取上清液，用0.22 μm 滤膜过滤并转移至进样瓶中。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱仪

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱[2.1 mm×100 mm，1.8 μm，沃特世科技(上海)有限公司]；柱温：40 ℃；流动相：0.1% (体积分数，下同)甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，流量为0.3 mL/min，梯度洗脱；梯度洗脱程序：0～1 min时B体积分数为2%，1～22 mim时B 体积分数为2%～95%，22～26.4 min 时B 体积分数为95%，26.4～26.5 min时B体积分数为95%～2%，26.5～30 min 时B 体积分数为2%；自动进样器温度：10 ℃；进样体积：5 μL。

1.3.2 质谱仪

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正、负离子扫描模式；扫描范围：m/z50～1 000；扫描时间：0.5 s；毛细管电压：3 kV；锥孔电压：30 V；碰撞能量：低能量为6 V，高能量为20～45 V；锥孔气流量：50 L/h；离子源温度：100 ℃；去溶剂化温度：400 ℃；去溶剂气流量：600 L/h。

1.4 化合物结构鉴定

胶囊中各单味中药化学成分的名称、化学式、结构式等均从中药系统数据库及分析平台[4]及文献中收集，根据收集的信息建立甘舒诺丹化学成分数据库，并将其导入沃特世UNIFI 2.0软件中。将在正负离子模式下通过UPLC-Q-TOF/MS 采集得到的原始质谱数据与UNIFI 2.0 软件中的自建胶囊化学成分数据库进行自动匹配，正离子模式下的加合离子选择+H和+Na，负离子模式下的加合离子选择-H和+HCOO，选择离子质量偏差在2 mDa范围内的化合物。最后通过查阅文献，根据化合物的典型裂解规律对化合物进行鉴定和验证，得到最终结果。

2 结果与讨论

2.1 实验条件优化

2.1.1 样品处理

分别选择甲醇-水(3∶7，体积比，下同)、甲醇-水(1∶1)、甲醇-水(7∶3)、甲醇作为提取溶剂超声提取样品。结果发现，与其它三种溶剂相比，以甲醇为提取溶剂时，样品溶液的总离子流图中有效成分峰更多，响应值较高，因此选择甲醇作为提取溶剂。

为促进化合物的电离，提高离子响应值，通常需在流动相中加入适量的甲酸。分别选择体积分数为0.1%、0.2%、0.5%甲酸水溶液作为A 相，乙腈作为B 相，考察流动相对实验结果的影响。结果表明，不同体积分数甲酸水溶液对色谱峰形与响应值没有显著影响，最终选择0.1%甲酸水溶液作为流动相A 相。

2.2 胶囊化学成分鉴定结果

通过UPLC-Q-TOF/MS 系统对胶囊水提取物的化学成分进行分析鉴定，分别采集样品溶液在正、负离子模式下的数据，得到胶囊水提物的总离子流(TIC)色谱图，如图1所示。该方法从胶囊中共鉴定出76种化学成分，其中醌类化合物有21种，黄酮类化合物有18 种，有机酸类化合物有11 种，萜类化合物有7种，香豆素类化合物有3种，木脂素类化合物有1种，其它类化合物有15种。对鉴定出的76个化合物进行药材归属，其中有39 种化合物来自丹参，18种化合物来自灵芝，11种化合物来自黄芪，9种化合物来自葛根，其中序号为30 的化合物为葛根、黄芪共有成分。化合物具体信息见表1。

表1 胶囊水提物化学成分鉴定和药材归属结果

图1 胶囊水提物在不同离子模式下的总离子流（TIC）色谱图

2.3 化合物质谱解析

2.3.1 醌类化合物的鉴定

在胶囊水提物中共鉴定出21种醌类化合物，均为丹参酮类化合物，且全部来源于丹参。丹参酮类化合物表现出抗菌、抗肿瘤、心血管保护以及抑制神经退行性疾病等优良的药理活性。这21 种丹参酮类化合物均具备邻醌或者对醌的结构，因此极易发生还原反应，被氧化为酚酸类衍生物。以丹参酮ⅡA 为例，在正离子模式下，其准分子离子峰为295.133 3[M+H]+，该化合物的元素组成为C19H18O3。母离子脱去两分子的CO 可得m/z239.068 8[C17H19O]+的一对同分异构体。根据裂解碎片信息并查阅文献推断该化合物为丹参酮ⅡA，可能裂解过程见图2。

图2 丹参酮ⅡA的可能裂解过程

2.3.2 黄酮类化合物的鉴定

在胶囊水提物中共鉴定出18种黄酮类化合物，其中8种来源于黄芪，7种来源于葛根，2种来源于丹参，还有1 种为黄芪和葛根共有的化合物。黄酮苷类化合物第一步通常是脱去糖基形成黄酮苷元，黄酮苷元的裂解规律则和黄酮类化合物一致，即黄酮母核结构中的C环的C1位、C3位，C0位、C4位容易发生RDA裂解反应，从而产生A环和B环两种碎片离子。以熊竹素为例，在正离子模式下，化合物20的准分子离子峰为315.086 3[M+H]+，且其元素组成为C17H14O6。 母离子脱去一分子甲基得m/z300.062 8[C16H12O6]+，然后以断裂1 和3 键的方式断裂脱去B 环得m/z167.033 9[C8H7O4]+。根据裂解碎片信息并查阅文献推断该化合物为熊竹素，可能裂解过程见图3。

图3 熊竹素的可能裂解过程

2.3.3 有机酸类化合物的鉴定

在胶囊水提物中共鉴定出11 种有机酸类化合物，其中6种来源于灵芝，4种来源于丹参，1种来源于黄芪。有机酸类化合物主要包括脂肪族、芳香族和萜类3类化合物，具有抗炎症、抗氧化、抑制血小板凝集等药理作用。有机酸分子是含有羧酸的化合物，所以主要通过脱去羧基生成其特征离子碎片。以香叶酸A为例，在正离子模式下，其准分子离子峰为313.071 1[M+H]+，该化合物得元素组成为C17H12O6。 母 离 子 脱 去 一 分 子C11H7O4得m/z110.035 2[C6H6O2]+，或者脱去一分子C3H3O2和一分子C6H6O2得m/z133.028 1[C8H5O2]+。根据裂解碎片信息并查阅文献推断该化合物为香叶酸A，可能裂解过程见图4。

图4 香叶酸A的可能裂解过程

2.3.4 萜类化合物的鉴定

在胶囊水提物中共鉴定出7 种萜类化合物，其中5种来源于灵芝，2种来源于丹参。萜类化合物分布极为广泛，是天然产物中数量较多的一类化合物。根据结构中异戊二烯基的数量可以分为单萜、倍半萜、二萜以及三萜等。以柳杉酚为例，在正离子模式下，其准分子离子峰为301.216 2[M+H]+，该化合物的元素组成为C20H28O2。母离子脱去一分子C2H2O得m/z259.169 0[C18H27O]+。根据裂解碎片信息并查阅文献推断该化合物为柳杉酚，可能裂解过程见图5。

图5 柳杉酚的可能裂解过程

2.3.5 香豆素类化合物的鉴定

在胶囊水提物中共鉴定出3 种香豆素类化合物，其中2种化合物来源于丹参，另外1种化合物来源于葛根。香豆素类化合物是指α-苯并吡喃酮及其衍生物，属于苯丙素类化合物，根据香豆素环上取代基和位置的不同，可分为简单香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素和其它香豆素。以6，7-二甲氧基香豆素为例，在正离子模式下的准分子离子峰207.065 0[M+H]+，该化合物的元素组成为C11H10O4。母离子脱去一分子C3H2O 得m/z153.053 3[C8H9O3]+。根据裂解碎片信息并查阅文献推断该化合物为6，7-二甲氧基香豆素，可能裂解过程见图6。

图6 6，7-二甲氧基香豆素的可能裂解过程

3 结语

甘舒诺丹灵芝孢子粉葛根丹参黄芪胶囊作为一种具有辅助保肝作用的保健食品，其药效作用源于其主要成分如醌类、黄酮类等化学成分。采用UPLC-QTOF/MS技术，根据质谱数据结合自建数据库，通过准确相对分子质量、碎片离子信息以及裂解规律等方式从甘舒诺丹胶囊中共鉴定出76种成分，其中醌类和黄酮类化合物占比最大，高达51%。采用UPLC-QTOF/MS 结合UNIFI 软件的方法，可以快速鉴别甘舒诺丹胶囊提取物中的化学成分，但是该方法仍难于有效区分同分异构体，也无法避免煎煮方式造成的药效物质基础改变，有待进一步研究。