丹参活性成分防治骨关节炎作用机制的研究进展

戴娜 王从安 师彬

中医将骨关节炎归为“骨痹”范畴,其病机特点为痹证多瘀血,“瘀”贯穿整个疾病始终,治疗当以活血祛瘀治疗其标,再辨证论治求本,丹参是典型的活血祛瘀药物,可用于治疗多种痹证[1]。丹参的活性成分包括水溶性酚酸类和脂溶性丹参酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗血栓、抗凝、改善微循环、抗肿瘤等多种功效[2]。丹参的活性成分中水溶性酚酸类包括丹参素、丹酚酸A、丹酚酸B等,脂溶性丹参酮类包括丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ、隐丹参酮等,临床主要的丹参类制剂包括注射用丹参多酚酸、注射用丹参多酚酸盐、丹红注射液等,临床广泛用于心脑血管病的治疗[3]。但目前丹参类制剂用于骨关节炎的研究尚少。袁长深等[4]运用网络药理学分析,丹参的活性成分可作用于骨关节炎65个靶基因,发挥抗骨关节炎作用。本研究通过统计整理国内外近年来丹参活性成分用于骨关节炎的相关研究,综述了其作用机制,为丹参的新药开发提供理论支持。

1 丹参活性成分通过减轻炎症反应延缓骨关节炎的进展

甲氨喋呤作为抗炎药临床广泛用于膝骨关节炎,但其免疫抑制剂的特性显著性了长期使用,寻找膝骨关节炎更佳的抗炎药物迫在眉睫,丹参酮为膝骨关节炎的治疗开辟了新的思路[5]。孙晓娟等[5]对膝骨关节炎大鼠模型运用丹参酮连续治疗21天后,与甲氨喋呤组相比,丹参酮组降低大鼠膝关节炎指数评分作用相似,证实丹参酮对膝骨关节炎具有较好的抗炎活性,经荧光素酶基因活性方法对比,经55%洗脱液的丹参酮乙醇提取液的抗炎活性最高。丹参多种活性成分具有良好的抗炎活性,机制包括抑制白介素1β(interleukin 1 β,IL-1β)的活性、下调低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)/血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达、上调β抑制蛋白2(β-arrestin2)的表达、阻止toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)/ 髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)/ 核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的激活发挥抗炎作用。

1.1 丹参活性成分通过抑制IL-1β的活性发挥抗炎作用

IL-1β在骨关节炎的炎症反应中起着关键作用, IL-1β能促使NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等多种炎症信号通路活化,加剧骨关节炎的炎症反应。丹参酸A可通过抑制IL-1β的活性发挥抗炎作用[6-9]。

Feng S等[7]运用24 ng/mL的IL-1β刺激人原代软骨细胞后发现,诱导性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,iNOS)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)等炎症介质表达明显增强,p-65/NF-κB、p-38/MAPK的水平明显提高,经10、20、40 μg/mL的丹参酸A处理2小时后,呈剂量依赖性促使COX-2、iNOS的表达明显下降,总p-65、p-38的表达显著降低,与IL-1β组对比差异显著(P<0.01),提示,丹参酸A通过下调NF-κB和p38/MAPK途径发挥抗炎活性。

Lou YT等[8]进行体内和体外的实验发现,25、50、100 μmol/L丹酚酸B呈浓度依赖性抑制IL-1β刺激人软骨细胞引起的COX-2、iNOS、一氧化氮(nitric oxide,NO)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)水平升高,阻止IL-1β诱导的NF-κB p65的信号通路激活和核易位,进一步降低骨性关节炎的炎性损伤。

Feng ZH等[9]研究也证实,5、10、20 μmol/L的隐丹参酮能以浓度依赖性降低IL-1β刺激引起的人类骨关节炎软骨细胞NO、PGE2、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎症介质的表达,阻止NF-κB、MAPK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)的活化及p65核易位,通过抗炎活性延缓骨关节炎的进展。

1.2 丹参活性成分通过下调低HIF-1/VEGF的表达发挥抗炎作用

HIF-1/VEGF信号通路,参与骨关节炎的炎症反应和血管形成,丹酚酸B可通过抑制该通路减轻骨关节炎的炎症程度[10]。与骨关节炎大鼠相比,10、40 mg/kg丹酚酸B处理后大鼠软骨中HIF-1、VEGF、TNF-α、IL-6、iNOS的表达显著降低,丹酚酸B+HIF-1激活组的VEGF、TNF-α、IL-6、iNOS水平较单纯丹酚酸B处理组的高(P<0.05),运用CT机检测几组大鼠的关节炎软骨的骨体积分数和踝骨表面积与骨体积比值也显示出了与上述指标相似的变化,表明丹酚酸B可通过下调HIF-1/VEGF的表达,以降低炎症反应,减轻软骨组织的损伤[10]。

1.3 丹参活性成分通过上调β-arrestin2的表达发挥抗炎作用

β-arrestin2是NF-κB的上游细胞因子,其过表达可抑制NF-κB的激活,丹参酮ⅡA可通过促进β-arrestin2的表达,发挥抗炎活性[12]。IL-1β可促使大鼠软骨细胞中NF-κB激活及诱导多种炎症介质的分泌已得到多篇研究证实[8-9, 11],与IL-1β组相比,25、50 μmol/L的丹参酮ⅡA处理大鼠软骨细胞后,β-arrestin2的表达明显升高,NF-κB/p56的表达显著降低,证实,丹参酮ⅡA可通过促进β-arrestin2的表达以减轻如昂细胞的炎症反应[12]。

1.4 丹参活性成分通过阻止TLR4/MyD88/NF-κB的激活发挥抗炎作用

TLR4/Myd88/NF-κB的激活与骨关节炎的发生与发展密切相关,丹参酮ⅡA可通过抑制该通路的激活以抑制局部炎症反应[13]。张金峰等[13]通过丹参酮ⅡA治疗前交叉韧带切断术建立的膝骨关节炎大鼠,与空白组对比,10、20、50 mg/kg的丹参酮ⅡA能显著降低大鼠关节组织和血清中IL-1β、TNF-α、IL-6等炎症因子的表达(P<0.05),显著抑制软骨组织中TLR4、Myd88、NF-κB蛋白的表达(P<0.05),阻止NF-κB p56蛋白核易位,发挥显著抗炎活性。

2 丹参活性成分通过保护软骨细胞减轻软骨组织损伤

丹参活性成分通过抑制IL-1β诱导的软骨降解,调节软骨细胞去分化,提高TGF-β1的活性,对软骨细胞发挥保护作用,以延缓软骨的病理改变,促进软骨组织的形成,延缓骨关节炎的进展。

2.1 丹参活性成分通过抑制软骨降解对软骨细胞发挥保护作用

骨性关节炎的主要病理特征为进行性软骨降解,IL-1β可诱导软骨细胞分泌中性金属蛋白酶,如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1、MMP-13、聚蛋白多糖酶(aggrecanase,ADAMTS)-5,还能抑制蛋白多糖和胶原蛋白Ⅱ的合成来影响软骨细胞的合成代谢活性,最终引起软骨降解和骨质破坏,丹参多种活性成分可通过抑制软骨降解,延缓骨关节炎的进展[11-15]。Wang XP等[11]丹参酮I用于软骨细胞系CHON-001的体外实验中,使用10 ng/mL IL-1β刺激72小时后,胶原蛋白II、聚集胶、SOX001的表达显著降低(P<0.05),MMP-13和p-NF-κB的表达显著提高(P<0.05),经10、20 μmol/L的丹参酮I处理后,逆转了IL-1β引起的上述改变(P<0.05),降低骨关节炎小鼠的国际骨关节炎研究学会(OARSI)评分、软骨下骨厚度和滑膜炎评分(P<0.05),显著阻止软骨细胞外基质降解,有助于控抑制骨关节炎病情的发展。经IL-1β刺激后,MMP-1、MMP-13、ADAMTS-5的表达明显高于未被IL-1β处理的人原代软骨细胞(P<0.05),经10、20、40 μg/mL的丹参酸A处理后MMP-1、MMP-13、ADAMTS-5的水平显著降低(P<0.05),抑制效果存在浓度依赖性[7]。一项丹参酸A用于小鼠软骨细胞的体外实验中,与未被IL-1β处理的相比,经10 ng/mL的IL-1β处理的大鼠软骨细胞胶原蛋白Ⅱ的产生显著下降(P<0.05),MMP-3、ADAMTS-5的水平显著提高(P<0.05),运用6.25、12.5、25 μmol/L的丹参酸A处理后,以浓度依赖性促使胶原蛋白Ⅱ的分泌,同时抑制MMP-3、ADAMTS-5的表达,以阻止小鼠软骨细胞细胞外基质的降解[6]。丹参酮ⅡA能逆转IL-1β刺激大鼠软骨细胞引起的MMP-1、MMP-3、MMP-13的高表达和胶原蛋白Ⅱ、聚蛋白多糖酶的低表达,从而显著降低软骨细胞排列紊乱、表面粗糙、软骨层变薄等病理学改变,有效阻止软管基质降解[12]。Jia PT等[14]通过前交叉韧带横断和内侧半月板切除术建立骨关节炎大鼠模型,经0.25～0.5 mg/kg的丹参酮ⅡA处理后,不仅显著抑制了TNF-α、IL-1β、iNOS的表达,还使软骨中MMP-13的表达显著降低(P<0.05),基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)的表达显著升高(P<0.05),有效延缓骨关节炎形成过程中软骨降解的进程。闵亚林等[15]使用丹参水提液治疗骨关节炎大鼠,5 mg/kg的丹参水提液可有效逆转碘乙酸钠引起的大鼠血清MMP-13升高,显著提高软骨体积和厚度,延缓软骨细胞的病理变化。

2.2 丹参活性成分通过调节软骨细胞去分化对软骨细胞发挥保护作用

软骨细胞去分化后将失去成软骨特征,并显示出成纤维细胞样形态,失去其结构和功能,丹参酮ⅡA可通过调节软骨细胞去分化的发生,以减轻软骨组织的损伤[6]。Zhang Y S等[16]采用网络药理学方法筛选发现,丹参酮IIA可通过7个hub基因在内的28个靶点参与软骨去分化进程,通过促进结缔组织、细胞外基质、骨骼系统、软骨发育和软骨细胞分化,调节软骨细胞去分化的发生和发展,促进骨性关节炎软骨的修复;值得注意的是,丹参酮IIA在100～200 μg/mL的浓度下可促进了软骨细胞的体外增殖和活力,但在400 μg/mL下可抑制软骨细胞的增殖和活力。

2.3 丹参活性成分通过提高转化生长因子β1 (transforming growth factor β1,TGF-β1)的活性以减轻软骨的病理改变

TGF-β1参与软骨的形成,可维持软骨细胞的功能,抑制MMP的活性,丹参活性成分可通过促进TGF-β1的分泌促进和维持软骨细胞的功能[14]。与模型组相比,10 mg/kg的丹酚酸A治疗前交叉韧带横断术建立的骨关节炎大鼠4周后,能促使大鼠软骨组织中TGF-β1的表达,显著提高p-Smad2/Smad2的水平,有效减轻骨关节炎的软骨组织损伤[17]。前交叉韧带横断和内侧半月板切除术建立的骨关节炎大鼠模型,可导致软骨细胞中TGF-β1、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的表达显著,运用0.5 mg/kg的丹参酮IIA可促使软骨细胞中TGF-β1、BMP-2的表达,进而促进成软骨细胞的增殖和分化,促进软骨的形成[14]。

3 丹参活性成分通过抑制软骨细胞凋亡延缓骨关节炎的进展

过度的细胞凋亡能导致软骨细胞减少,关节软骨结构和功能受到影响,丹参活性成分可通过抑制细胞凋亡对软骨发挥保护作用[18]。展嘉文等[18]运用丹酚酸A治疗持续加压建立的腰椎小关节骨关节炎兔的实验,与模型组相比,腹腔注射40 mg/kg的丹酚酸A可显著降低软骨细胞凋亡率(P<0.05),还可显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,减轻软骨组织的病理改变。丹参活性成分通过调节凋亡相关蛋白的分泌,抑制IL-1β诱导的细胞凋亡,阻断JAK2/STAT3信号通路,抑制软骨细胞凋亡,以减轻软骨组织损伤,发挥抗骨性关节炎的作用。

3.1 丹参活性成分通过调节凋亡相关蛋白的分泌抑制细胞凋亡

一项丹参注射液用于兔软骨细胞的体外实验中,给予0～400 μg/L的丹参注射液按照梯度时间法进行干预,各梯度的丹参注射液均可显著提高软骨细胞的活性,显著提高软骨细胞的增殖效率,并在100 μg/L时兔软骨细胞可获得最大的活性,诱导凋亡第3代细胞经丹参注射液处理后,Bcl-2相关X蛋白(BCL2-Associated X,Bax)基因表达明显降低,B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)基因表达明显升高,结果证实,丹参注射液能通过调节凋亡相关蛋白抑制线粒体凋亡通路活性[19]。

3.2 丹参活性成分通过抑制IL-1β诱导的细胞凋亡发挥抗凋亡活性

IL-1β可通过增加Bax和半胱天冬酶3的水平诱导软骨细胞凋亡。丹参可通过抑制IL-β的分泌以发挥抗细胞凋亡活性[6,11]。Wu YF等[6]为检验丹参酸A抑制IL-1β诱导的小鼠软骨细胞凋亡的实验结果显示,小鼠软骨细胞经10 ng/mL的IL-1β刺激后,Bax和裂解的半胱天冬酶-3的表达明显提高,Bcl-2的表达明显受到抑制,小鼠软骨细胞的数量显著提高,经6.25、12.5、25 μmol/L的丹参酸A处理后,Bax和裂解的半胱天冬酶-3的表达显著降低,Bcl-2显著提高,以浓度依赖性逆转了凋亡相关蛋白的表达,显著降低了软骨细胞的凋亡。一项体外研究证实,10 ng/mL的IL-1β可促使软骨细胞系CHON-001细胞凋亡,经20 μmol/L的丹参酮I处理后,丹参酮I逆转了IL-1β诱导的细胞凋亡,CHON-001的凋亡率显著降低[11]。

3.3 丹参活性成分通过阻断Janus 激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/转录信号传感器和激活剂3(Transcription signal sensors and activators 3,STAT3)信号通路抑制软骨细胞凋亡

JAK2/STAT3信号通路参与调节软骨细胞自噬和凋亡,丹参活性成分可通过调节该通路阻止细胞凋亡[20-21]。棕榈酸能促进软骨细胞中p-JAK2、p-STAT3水平的升高,分别给予JSI-124(JAK2/STAT3抑制剂)、丹参酸B进行干预,二者均能降低p-JAK2、p-STAT3的水平,同时能提高LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1的水平,提示,丹参酸B能通过抑制JAK2/STAT3信号通路,增强软骨细胞自噬,以阻止细胞凋亡进程,延缓骨关节炎的进程[20]。Xu XL等[21]通过手术建立实验性骨关节炎兔模型,分别给予1.05 g/d丹参注射液、0.4 mL/d透明质酸钠、生理盐水连续治疗5周,与假手术相比,实验性骨关节炎兔模型组的p-JAK2和p-STAT3水平的表达显著提高,丹参注射液组和透明质酸钠组均使p-JAK2和p-STAT3水平显著下降,显著抑制软骨细胞凋亡,为进一步验证丹参对JAK2/STAT3的作用,同时给予AG490(JAK2/STAT3促进剂)进行干预,结果AG490消除了丹参对JAK2/STAT3的抑制作用,结果证实丹参注射液可通过阻断JAK2/STAT3信号通路,抑制软骨细胞凋亡,延缓软骨退变进程。

4 丹参活性成分调节非编码RNA的分泌以延缓骨关节炎的进展

丹参活性成分通过调节KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1 overlapping transcript 1,KCNQ1OT1)、miR-155、miR-106a-5p、miR-574-5p的分泌以延缓骨关节炎的进展。

4.1 丹参活性成分通过调节KCNQ1OT1延缓骨关节炎发展

KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1 overlapping transcript 1,KCNQ1OT1)属于长非编码RNA,在骨关节软骨细胞中表达下调,丹参酸B可通过调节KCNQ1OT1的分泌发挥抗骨关节炎的作用[20]。

Sun TW等[20]通过前交叉韧带横断和内侧半月板切除术建立骨关节炎小鼠,并给予高脂肪饮食喂养建立肥胖相关骨关节炎小鼠模型,给予25 mg/kg的丹参酸B腹腔注射持续治疗10周,与空白对照组相关,丹参酸B显著降低了小鼠的体重,提高了软骨细胞中KCNQ1OT1的表达,降低了TNF-α、IL-6和PGE2的水平,对miR-128-3p发挥负调控作用,提高了SIRT1的表达,显著降低了小鼠软骨细胞的凋亡,激活软骨细胞自噬,而过表达的miR-128-3p和低表达的SIRT1能进一步加重小鼠软骨细胞的炎症反应、细胞凋亡,结果提示,丹参酸B能靶向调节KCNQ1OT1的分泌,通过miR-128-3p/SIRT1信号通路调节软骨细胞自噬,减轻炎症反应和抑制细胞凋亡,以延缓肥胖相关骨关节炎的进展。

4.2 丹参活性成分通过调节多种miRNA的分泌延缓骨关节炎进展

微小核糖核酸(MicroRNA,miRNA)是维持软骨稳态的关键调节剂,miR-155、miR-106a-5p等多种miRNA参与骨关节炎的发生与发展,丹参活性成分可通过调节miR-155、miR-106a的表达发挥抗抗骨关节炎作用[22-25]。

Zhou B等[22]将丹参酮ⅡA干预脂多糖刺激人原代关节软骨细胞的实验发现,脂多糖能促使人原代关节软骨细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6等多种炎症因子的分泌,促进软骨细胞中miR-155-5p的低表达及叉头框蛋白O3(Forkhead box O3,FOXO3)高表达,进一步促进细胞凋亡,1、10、100 μmol/L的丹参酮ⅡA干预后,逆转了炎症因子的高表达,通过上调miR-155-5p的表达和抑制FOXO3的表达,通过转染miR-155证明了,丹参酮ⅡA可直接作用于miR-155/FOXO3发挥抗炎和抑制细胞凋亡的作用。一项关于丹参酮ⅡA干预聚乙烯诱导骨溶解大鼠的实验中,30 mg/kg的丹参酮ⅡA显著降低骨溶解的病理改变,抑制血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌,诱导的miR-155-5p水平并抑制FOXO3表达,有助于改善骨保护素(osteoprotegerin,OPG)和破骨细胞分化因子(receptor acti-vator nuclearfactor kappa B ligand,RANKL)的平衡,恢复成骨细胞的数量和活力,发挥抗骨溶解作用[23]。

Ji QB等[24]将隐丹参酮用于人膝骨性关节炎软骨细胞的实验发现,10 μmol/L的隐丹参酮能以时间依赖性方式促进miR-106a-5p在人软骨细胞中的表达,miR-106a-5p可减轻骨性关节炎中软骨的损伤,使用靶标预测程序研究发现, miR-106a-5p能直接靶向下调人软骨细胞中的GLI家族锌指蛋白3(GLI-similar 3,GLIS3)的过表达,配对盒基因5(paired box gene 5,PAX5)可能是隐丹参酮调节miR-106a-5p启动子活性的转录因子,miR-106a-5p与 PAX5 表达呈正相关,与 GLIS3 表达呈负相关,结果证实隐丹参酮可能通过调节AX5/miR-106a-5p/GLIS3轴的活性,发挥防治骨性关节炎的作用。

Yue ST等[25]基于微阵列数据集GSE93008筛选显示,miR-574-5p在骨关节炎的变化最为显著,给予IL-1β刺激后能促使miR-574-5p的表达明显升高,YAF2受到抑制,miR-574-5p能调节YAF2的分泌,经10 mg/kg的隐丹参酮处理后,miR-574-5p的表达受到明显抑制,进一步促进YAF2的表达,进而抑制骨关节炎的软骨细胞凋亡。

5 结语

骨关节炎的病理机制复杂,多种病理学改变相互影响,中药在骨关节炎防治中的多靶点、价廉效优、安全性高等特点越来越受到广大学者的关注[26]。本研究综述了近7年的相关研究报道,从炎症反应、软骨降解、细胞凋亡、非编码RNA四个方面探讨丹参活性成分防治骨关节炎的作用机制。目前丹参用于骨关节炎的研究大部分停留于基础实验,在人体的疗效及作用机制尚不明确。丹参的活性成分复杂用于骨关节炎的作用存在不同作用机制,各成分间的相互作用尚未可知。丹参在人体的使用可造成不同程度的不良反应,在防治骨关节炎的最低有效浓度及毒效关系仍需进一步研究确认。望后续的研究者开展丹参治疗骨关节炎的多中心、多样本的临床研究,为明确丹参在临床的作用机制及安全性提供可靠数据。