土槿皮乙酸在消化系统肿瘤中抗癌机制的研究进展

杨珂 于飞

近年来,消化系统肿瘤因高发病率和高致死率严重威胁着人类的生命健康[1-2]。常用的治疗方法如放化疗常伴随副作用明显、易产生耐药性等弊端,许多研究者发现天然植物药治疗肿瘤具有多靶点、多途径、细胞毒性小等优点[3-4],近些年逐渐成为癌症治疗中的研究热点。

中药土槿皮又名土荆皮,为我国特有松科植物金钱松的干燥根皮或近根树皮,始载于赵学敏的《本草纲目拾遗》,具有抗真菌作用。土槿皮乙酸(pseudolaric acid B,PAB)是从中药土槿皮中分离得到的二萜类化合物,也是中药土槿皮的主要活性成分[5]。CAI T等[6]首次从土槿皮中分离得到PAB,并鉴定得出其化学结构为C23H28O8。现有研究表明,PAB具有多种生物活性,包括抗炎[7]、抗真菌[8-9]、抗微管聚集[10-11]、抗血管生成[12]、抗肿瘤[13]等,且细胞毒性较小[14-15]。目前,PAB已被证实在多种肿瘤中均具有有效的抑癌作用,如肝癌、宫颈癌[16]、乳腺癌[17]、头颈癌[18]以及肺癌[19]等。本文拟对天然植物药土槿皮乙酸在消化系统肿瘤中的最新研究进行归纳总结,以期探究其抗消化系统恶性肿瘤的作用机制,为将来应用于临床治疗提供理论依据。

1 通过抑制细胞增殖发挥抗肿瘤作用

不受调控的异常增殖能力是肿瘤细胞区别于正常细胞的重要标志,抑制肿瘤细胞的恶性增殖也是开发新型抗癌药物、寻找新型肿瘤治疗方法的关键[20]。多项研究表明,PAB可以有效抑制多种消化系统肿瘤细胞的增殖进而发挥抗肿瘤作用。

1.1 抑制Ki67表达

Ki67是一种细胞增殖相关基因,也是目前公认的细胞增殖标志物,在判定肿瘤恶性程度以及预后中具有重要的意义[21]。Yin Z等[22]关于食管癌的研究发现,PAB能够下调食管癌细胞和肿瘤组织中Ki67的表达水平,从而抑制细胞增殖及成瘤能力。Wang D等[23]通过构建胃癌裸鼠模型发现,与对照组相比,PAB治疗组的裸鼠移植瘤生长速率明显下降,免疫组化染色结果显示,经PAB治疗的肿瘤组织中Ki67表达水平明显低于对照组。目前,PAB对消化系统肿瘤细胞Ki67调控的研究较少,但现有的研究结果显示,PAB可能通过下调消化系统肿瘤细胞中Ki67的表达而发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用。

1.2 阻滞细胞周期

细胞增殖是生命体得以繁衍的基础,细胞周期在增殖中具有重要的作用,近年来,许多研究者证明多种中草药成分能够通过阻滞肿瘤细胞周期有效地抑制肿瘤增殖,土槿皮乙酸在消化系统肿瘤中也具有同样的抑癌作用。

细胞周期的正常进行依赖于细胞周期蛋白(Cyclin)家族中各成员的正常表达以及细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)的激活[24]。肿瘤抑制因子p21是一种CDK抑制剂,能够阻断CDK1活性或降解细胞周期相关蛋白从而诱导G2/M期阻滞[25]。有关肝癌的研究证明,PAB通过上调肝癌细胞HepG2和SK-Hep-1中p21的表达,将细胞周期阻滞在G2/M期[15]。在胃癌研究中,以浓度为10 μM的PAB作用24小时能有效地将胃癌细胞的周期阻滞在G2/M期,但PAB对胃癌细胞周期阻滞的作用机制尚不清楚[23]。

α-微管蛋白(α-tubulin)是组成细胞骨架的重要组成部分,对维持细胞骨架有关键的作用[26],α-tubulin的功能遭到破坏直接影响分裂期细胞纺锤体的形成,导致细胞周期阻滞[27]。研究发现PAB通过下调肝癌细胞中α-tubulin的表达水平并影响其聚合能力引发细胞周期停滞,从而抑制细胞的增殖能力[28]。在有丝分裂中,纺锤体组装检查点(the spindle assembly checkpoint, SAC)与有丝分裂纺锤体的形成相互协调对有丝分裂的正常进行至关重要[29]。在结直肠癌的研究中,免疫荧光染色α-tubulin发现,PAB治疗组有丝分裂纺锤体的形态发生变异,进一步探究证明PAB促进BUBR1(SAC的核心成分)的磷酸化进而激活SAC,导致周期阻滞,由此证明PAB通过解聚α-tubulin骨架并激活SAC,妨碍纺锤体的生成,诱导结直肠癌细胞发生G2/M期周期阻滞[14]。综上所述,PAB可能通过多种方式导致消化系统肿瘤细胞的周期阻滞在G2/M期,干扰肿瘤细胞的正常周期循环,进而抑制肿瘤细胞分裂增殖。

1.3 其他机制

除上述通过调节增殖基因Ki67和阻滞细胞周期机制发挥抑制细胞增殖的作用外,PAB还具有其他作用靶点。Zhang H等[15]在肝癌的研究中发现,PAB通过下调肝癌细胞致癌转录因子c-Myc的表达,对肝癌细胞的增殖产生显著的抑制作用,并且浓度越大,作用时间越长,抑制效果越好。Li X等[30]在胰腺癌的研究中发现,对胰腺癌细胞施加PAB刺激后,细胞内Hippo-YAP通路被明显激活且细胞上皮间质转化能力明显减弱,最终导致了胰腺癌细胞的增殖抑制。另有研究表明,PAB对阿霉素耐药胃癌细胞株的增殖及其裸鼠移植瘤生长能力仍具有有效的抑制作用[31-32]。Wen C等[14]关于结直肠癌的研究发现,PAB有效抑制5-氟尿嘧啶耐药和非耐药细胞株裸鼠移植瘤生长。总而言之,针对于不同的消化系统肿瘤,PAB可能存在不同的抑制细胞增殖机制,这些机制仍有待被研究。

2 通过诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用

细胞凋亡,也被称为程序性细胞死亡,是一种自我清理的形式,机体以有序和有效的方式清除受损细胞,而凋亡的失调是肿瘤细胞无限增殖的主要原因。半胱氨酸天冬酶(Caspase)蛋白酶家族参与调控细胞凋亡的两种主要的凋亡途径:线粒体途径和死亡受体途径,是启动凋亡和执行凋亡的核心[33-34]。另外,Bcl-2家族、抑癌基因p53、多聚腺苷二磷酸核糖合成酶[poly(ADP-ribose) polymerase, PARP]在细胞凋亡中也发挥着重要作用[35-37]。PAB能够通过调控上述蛋白诱导消化系统肿瘤凋亡从而发挥抗肿瘤作用。

2.1 线粒体凋亡途径

线粒体凋亡通路又称为内源性凋亡,该通路的激活主要依赖线粒体膜电位的降低伴随细胞色素C从线粒体释放进入细胞质,随后刺激Caspase家族蛋白和其他凋亡调控基因的一系列激活[38]。在结直肠癌研究中,PAB降低RKO和HCT-15细胞线粒体膜电位,导致线粒体中细胞色素C释放进入细胞质,随后激活PARP、Caspase-3、Caspase-9的裂解并下调抗凋亡基因MCL-1、Bcl-2、Bcl-xl以及上调促凋亡基因Bax的蛋白表达水平,说明在结直肠癌中PAB是线粒体凋亡通路的有效激活剂[14]。在胃癌的研究中,Wang D等[23]发现PAB诱导的胃癌细胞的凋亡也主要与线粒体凋亡通路发有关,表现为上调p53、Bax、Caspase-3的同时下调Bcl-2,并降低线粒体膜电位。此外,肝癌相关研究表明PAB能够上调Bax/Bcl-2比例,促进Caspase-3和PARP裂解,并抑制抗凋亡蛋白Survivin的表达,最终导致肝癌细胞发生凋亡[15]。Yin Z等[22]研究食管癌发现,PAB下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达并上调促凋亡蛋白Bax、并促进Caspase-3和Caspase-9的裂解,最终引起食管癌细胞发生浓度依赖性凋亡。综上所述,在多种消化系统肿瘤中,PAB都能够诱导肿瘤细胞发生线粒体凋亡通路介导的细胞凋亡,进而发挥抑制肿瘤的作用。

2.2 死亡受体凋亡途径

死亡受体途径又称为外源性凋亡通路,该通路是由TNF死亡因子家族介导的凋亡通路,该家族的死亡因子活化后的一列反应会激活Caspase-8继而启动Caspase-3引发细胞凋亡[39]。魏忠宝[40]研究PAB在肝细胞癌中的抗癌机制发现,PAB既激活了死亡受体途径蛋白Caspase-8又激活了线粒体凋亡途径Caspase-9,这两种途径最终均通过Caspase-3启动了细胞凋亡程序,说明PAB能有效激活死亡受体和线粒体两种凋亡途径。关于PAB诱导死亡受体凋亡途径的研究十分有限,但上述PAB的交叉作用提示我们其诱导死亡受体凋亡途径的作用可能被忽略,需要更多研究去证实PAB在这方面的作用。

3 通过抑制细胞侵袭和迁移发挥抗肿瘤作用

不受控制的生长、对周围组织的侵袭以及向远处组织的转移是恶性肿瘤的重要特征[41]。肿瘤的转移更是导致患者死亡的最主要原因。在转移过程中,肿瘤细胞离开原发部位,扩散至全身,形成继发性肿瘤,造成严重的器官衰竭[42]。肿瘤细胞的远处转移离不开其对组织的侵袭和迁移,许多抗癌药物的作用机制均聚焦于抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移,PAB对消化系统肿瘤细胞的侵袭和迁移也具有抑制作用。

3.1 抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteases, MMPs)

MMPs是一种锌依赖的内源性蛋白酶,该类蛋白酶能够通过降解细胞外基质打破癌细胞迁移的物理屏障,最终导致肿瘤细胞的侵袭和迁移[43-44]。Yin Z等[22]发现,经PAB刺激后的食管癌TE-1细胞中MMP2、MMP3及MMP9的蛋白表达明显减少,进而抑制了细胞侵袭和迁移能力。李帅等[28]研究发现,PAB通过抑制MMP-9的蛋白表达浓度依赖性抑制肝癌细胞HepG2的侵袭和迁移。同样,Wang D等[23]研究发现PAB对胃癌细胞侵袭和迁移的抑制也可能是通过抑制MMP9来实现的。综上所述,PAB作用于消化系统肿瘤细胞后能显著抑制MMP的表达,减弱肿瘤细胞降解细胞外基质的能力,进而限制肿瘤细胞的侵袭和迁移。

3.2 抑制EMT

上皮—间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)是一种肿瘤细胞表型转化过程,具有间充质特性的肿瘤细胞侵袭和迁移能力更强[45]。Li X等[30]发现PAB能够抑制胰腺癌细胞间充质标志性蛋白如N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和纤维连接蛋白(Fibronectin)的表达,促进上皮标志性蛋白E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达,从而抑制胰腺癌细胞EMT的进程,最终导致胰腺癌细胞侵袭和迁移能力的减弱。此外,在胃癌的体内研究中,PAB还能通过上调E-cadherin的表达有效地抑制胃癌细胞的肺转移[23]。综上所述,PAB能够抑制消化系统肿瘤细胞的EMT,减弱其自身的表型转化能力,进而抑制肿瘤的侵袭和迁移。

4 通过抑制新血管生成发挥抗肿瘤作用

在肿瘤发生过程中,新生血管为肿瘤细胞的增殖提供氧气和营养,扩张的新血管也是肿瘤细胞转移的重要通道,最终导致肿瘤进展[46]。抑制肿瘤中新血管生成是寻找新型抗癌药物的重要方向。PAB对消化系统恶性肿瘤的新血管生成也有明显的抑制作用。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factors,VEGF)由肿瘤细胞和周围间质产生并分泌,能够刺激内皮细胞的增殖和存活,导致新血管的形成,对肿瘤的转移和复发具有十分重要的促进作用[47-48]。先前的研究发现,肺癌细胞中CD147能通过促进VEGF的表达诱导肺癌新血管生成[49]。在食管癌中,PAB能够下调食管癌细胞中CD147的表达从而减少VEGF的生成,最终抑制人脐静脉内皮细胞的增殖,引起肿瘤新血管生成障碍[22]。此外,Wang D等[23]通过免疫组织化学的方法对PAB治疗组和对照组的胃癌裸鼠移植瘤进行染色,发现PAB治疗组中VEGF及血管标记物CD31的表达均明显下降,这说明PAB对胃癌新血管的生成也具有抑制作用。综上所述,PAB能够通过抑制VEGF的表达水平从而抑制多种消化道肿瘤新血管的生成,发挥抗肿瘤作用。

5 通过逆转细胞耐药性发挥抗肿瘤作用

化学药物是恶性肿瘤治疗中非常重要的治疗手段,但是越来越多的肿瘤细胞产生耐药性,这成为肿瘤治疗中的一大难题,逆转肿瘤细胞耐药性逐渐成为肿瘤治疗研究的新方向[50]。目前研究发现,许多中药活性成分具有丰富而明确的靶点,与化疗药物联用可以逆转肿瘤细胞耐药性,有效提升化疗药物疗效[51]。

Li X等[30]研究发现,PAB与吉西他滨联用组对胰腺癌裸鼠移植瘤的抑制率明显高于对照组,这表明PAB也许能提高胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。Wen C等[14]对结直肠癌的研究发现,PAB通过诱导5-氟尿嘧啶耐药直肠癌细胞的凋亡和周期阻滞,体内实验也证实了PAB能有效地抑制耐药组裸鼠移植瘤的生长率,这说明PAB有助于逆转结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性。此外,胃癌的体内体外研究发现,PAB通过下调耐药相关基因Cox-2和P-gp的表达,诱导阿霉素耐药的胃癌细胞株发生凋亡并抑制其增殖,这说明PAB对阿霉素耐药的胃癌细胞仍具有抑制作用[31-32]。综上所述,PAB能够逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性并有效地增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,说明逆转耐药性可能是PAB的优异抗癌机制。

6 小结与展望

总之,PAB能够通过多种机制发挥抗消化系统肿瘤的作用,主要涉及抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、抑制侵袭和迁移、诱导细胞凋亡、抑制新血管生成、逆转肿瘤细胞耐药性,并且多种调节机制参与其中,如Ki67参与抑制肿瘤细胞增殖,Caspase家族和Bcl-2家族基因参与诱导细胞凋亡、以及EMT和MMP参与抑制肿瘤细胞侵袭和转移能力等,说明PAB在治疗消化系统肿瘤中具有多靶点、多途径的特点。PAB作为一种天然抗肿瘤药物,在消化系统肿瘤发展的多个过程中均具有调控作用,但是目前PAB在消化系统肿瘤中的作用靶点和信号通路以及体内的研究工作不够丰富。今后,随着对PAB多角度、深层次地研究,其在抗消化道肿瘤方面的作用机制也会更加明确,有望应用于消化系统肿瘤的临床治疗。