盐酸药根碱对宫颈癌细胞的抑制作用*

赵冰洁,曾凤娇,魏瑶璐,董 兰,贾爱亭,蔡 敬,宁志丰**

(1.湖北科技学院医学部药学院,湖北 咸宁 437100;2．湖北科技学院医学部基础医学院)

据2020年GLOBOCAN数据库统计结果显示,在全球女性癌症疾病中,宫颈癌排名第四,是女性癌症疾病中最常见的死亡原因[1]。自从2000年以后,宫颈癌在我们国家多发,呈现年轻化趋势,且死亡人数逐年增多[2]。患者常有阴道接触性和不规则性出血,同时月经量增大[3];又常常因为发病隐匿,一旦确诊,已是晚期患者,严重威胁女性的身体健康[4]。

药根碱来源于防己科植物的青牛胆、毛茛科中的黄连以及小檗科植物三颗针等分离得到的一种四氢异喹啉生物碱。盐酸药根碱的药理作用有降糖、降脂、抗菌、抗抑郁以及神经保护、抗肿瘤活性等,由于其安全性高及毒副作用小,有利于疾病的治疗[5]。研究表明[6],盐酸药根碱对黑色素瘤、乳腺癌、以及前列腺癌等多种肿瘤都有显著影响。目前,尚无盐酸药根碱对宫颈癌的药理研究。因此,本研究通过体外细胞实验探讨盐酸药根碱对宫颈癌细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人宫颈癌Hela细胞(湖南丰晖生物),DMEM高糖培养基(Gibco公司),牛血清白蛋白(Gibco公司),Hochest细胞染色试剂盒(中国碧云天生物公司),GAPDH、Bax、Bcl-2(ABelonal公司),盐酸药根碱来自于成都仪睿生物科技有限公司(HPLC检测纯度在98%以上)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

把Hela细胞放在T25瓶贴壁培养,其中加含有10%血清和DMEM高糖培养基,放于培养箱,待细胞状态较好时进行实验。

1.2.2 细胞增殖能力检测

取对数生长期的Hela细胞,将细胞以每孔7000个铺在96孔板中。每孔密度培养至80%时,分别加入不同浓度0、30、60、120、150μmol/L的盐酸药根碱处理48h,之后避光情况下每孔加入10μL的MTT溶液,用酶标仪在490nm 处检测吸光度值。细胞存活率=(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值,且设对照组存活率为1。MTT实验需重复3次。

1.2.3 细胞平板克隆形成

取对数生长期的Hela细胞,每孔以1000个铺到6孔板中,次日使用不同药物浓度0、5、8、15、30、40μmol/L的盐酸药根碱,放入培养箱14d左右,之后处理拍照并用ImageJ软件计数,克隆形成率%=实验组克隆形成的细胞数/对照组细胞数×100%。

1.2.4 细胞伤口愈合实验

取对数生长期的Hela细胞,以每孔10万个细胞铺在6孔板中,放入培养箱,待长满后可划痕,PBS洗涤之后每孔加入药物浓度为0、20、40、80μmol/L培养基2mL,培养0、48h后分别拍照。Image J软件计算迁移面积与初始面积之比。

1.2.5 Transwell小室侵袭与迁移实验

观测Hela细胞生长状态,密度达到90%左右时,加入无血清培养基饥饿12h,侵袭组上室加基质胶,迁移组不加,取Hela细胞,每孔10万个铺在Transwell小室的上室,在侵袭、迁移的下室加药物浓度为0、20、40、80μmol/L含双倍血清的高糖培养基,结晶紫染色,晾干后拍照并计数。细胞迁移率=实验组细胞数/空白对照组细胞数×100%,设定空白对照组细胞迁移率为100%。细胞侵袭率=实验组细胞数/空白对照组细胞数×100%,设定空白对照组的细胞侵袭率为100%。

1.2.6 细胞凋亡与坏死染色

观测Hela细胞生长状态,密度达到90%左右时,将细胞以每孔4万个铺在24孔板里,恒温箱培养,第2d吸去培养液,加入浓度为0、30、60、90μmol/L的盐酸药根碱培养基,药物全程避光,作用24h后,按照比例配置使细胞检测缓冲液与YO-PRO-1染液和PI染液,37℃孵育30min,结束后在荧光显微镜下拍照。

1.2.7 蛋白免疫印迹Western blot

观测Hela细胞生长状态,密度达到90%左右时,加入浓度为0、20、40、80μmol/L的盐酸药根碱处理48h后,提取Hela细胞蛋白,测BCA蛋白浓度,加入5倍Loading Buffer后,在金属浴中温度达到99.9℃的情况下煮沸10min,制胶,蛋白上样并电泳,随后转膜以及封闭。一抗4℃冰箱摇床过夜,次日加入二抗在室温摇床lh,最后进行显影并分析结果。

1.3 统计学方法

实验结果主要采用Image J和Graphpad prism 8.0软件进行数据分析。每个实验均重复3次,组间分别采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 盐酸药根碱抑制Hela细胞的增殖

通过MTT实验检验盐酸药根碱对Hela细胞增殖能力的影响,结果如图1A所示。显微镜下观察,不同浓度的盐酸药根碱作用于Hela细胞48h后,如图1B所示,随着盐酸药根碱浓度和给药时间的增加,Hela细胞活力下降且数量减少,说明盐酸药根碱可抑制宫颈癌Hela细胞增殖,且具有时间-浓度依赖性。

A.盐酸药根碱对Hela细胞48h后的增殖影响(与空白对照组比较,*P<0.05,n=3);B.盐酸药根碱作用于Hela细胞48h后的细胞白光图(×4)。

2.2 盐酸药根碱抑制Hela的克隆形成

采用平板克隆实验检测Hela细胞的克隆形成,该方法表达单个肿瘤细胞集落形成能力。

实验结果表明,如图2A、2B所示,与空白对照组相比,不同浓度的盐酸药根碱处理Hela细胞后,随着浓度增加,Hela细胞克隆能力逐渐下降。说明盐酸药根碱可呈浓度依赖性抑制宫颈癌Hela细胞的克隆形成。

A.不同浓度的盐酸药根碱对Hela细胞的克隆形成图;B.不同浓度盐酸药根碱对Hela细胞的克隆数统计图(与空白对照组比较,*P<0.05,n=3)。

2.3 盐酸药根碱抑制Hela细胞的横向迁移

为探讨盐酸药根碱能否抑制Hela细胞的横向迁移,本研究通过细胞伤口愈合实验检测。如图3A所示,与空白对照组比,Hela细胞的横向迁移能力随药物浓度的增加持续下降。如图3B、3C表示细胞横向迁移面积以及细胞伤口愈合比。结果显示,盐酸药根碱以浓度依赖性方式抑制Hela细胞横向迁移。

A.不同浓度的盐酸药根碱对Hela细胞横向迁移图(×4);0h为初始划痕图像,48h为细胞迁移48h后的图像;B.盐酸药根碱对Hela细胞迁移面积统计图;C.盐酸药根碱对Hela细胞的伤口愈合比(与对照组比较,*P<0.05,n=3)。

2.4 盐酸药根碱抑制Hela细胞的纵向迁移

通过Transwell迁移实验,检测该药物对Hela细胞纵向迁移能力的影响。从图4A、4B可见,与空白对照组相比,随着药物浓度的增加,盐酸药根碱可呈剂量依赖性抑制Hela细胞纵向迁移能力,给药组细胞的纵向迁移能力不断下降。

2.5 盐酸药根碱抑制Hela细胞的侵袭

通过Transwell侵袭实验,检测盐酸药根碱对Hela细胞侵袭能力的影响。结果如图5A、5B所示,与空白对照组相比,随着药物浓度的增加,给药组细胞的侵袭能力不断下降,说明该药物可呈浓度剂量依赖抑制Hela细胞的侵袭。

A.不同浓度的盐酸药根碱抑制Hela细胞侵袭能力图(×10);B.盐酸药根碱对Hela细胞侵袭能力统计图(与空白对照组比,*P<0.05,n=3)。

2.6 盐酸药根碱诱导Hela细胞的凋亡和坏死实验

通过凋亡与坏死试剂盒检测,结果如图6所示,正常细胞不会被YO-PR0-1以及PI染色,经过不同浓度的盐酸药根碱诱导24h后的Hele细胞产生明显的凋亡,凋亡细胞的细胞核被YO-PR0-1染色为绿色荧光,坏死细胞的细胞核同时被YO-PR0-1和PI染色,红色荧光和绿色荧光重叠呈现橙黄色。

2.7 盐酸药根碱调控Hela细胞蛋白的表达

Western blot结果如图7,与对照组相比,药物作用于Hela细胞后Bax表达上调,然而Bcl-2表达下调以促进细胞的凋亡,并具有统计学意义(P<0.05)。

A.经不同浓度盐酸药根碱干预24h后相关蛋白的表达情况;B.Bcl-2灰度值统计结果;C.Bax灰度值统计结果(与空白对照组比较,*P<0.05,n=3)。

3 讨 论

2020年为止,在全球23个国家,宫颈癌新发病例604 000例,死亡病例342 000例,是最常见也是导致女性生殖系统主要死亡原因的恶性肿瘤[1]。这类疾病以高复发率和高转移率为特点,因此女性身体健康受到严重威胁[7]。

盐酸药根碱具有杀菌、消炎、清热解毒的功效。如今,盐酸药根碱的某些新的药理作用也开始逐渐被发现,例如降糖[8]、降脂[9]和神经保护[10]作用。研究表明,盐酸药根碱具有多种抗癌活性,可以通过多方面发挥抗癌效果。如刘洋等[6]发现盐酸药根碱通过降低Snail、N-cadherin、MTA1的表达,上调E-cadherin来抑制MTA1中的蛋白,影响细胞内转录因子Snail,从而调整EMT进程,增强细胞之间的粘附,降低PC-3的活力,逆转EMT过程。Liu Ruifang等[11]发现该药物能上调P21、P53,抑制黑色素瘤的增殖以及新生血管的形成。Yanfang Sun等[12]发现该药物以TNIK为靶点,抑制Wnt/β-catenin信号通路,延缓EMT过程,上调Bax,下调Bcl-2促进乳腺癌细胞凋亡。KeBin Lu等[13]发现该药物可使甲状腺癌细胞周期阻断,增加ROS,Caspase-3和p-H2Ax表达上调,PI3K/AKT/mTOR下调,促进DNA损伤。

在本研究中,我们观察浓度不同的药物盐酸药根碱作用于Hela细胞后,对细胞增殖活力的影响,随药物浓度的增加而减少,通过药物处理后,Hela细胞的划痕有了显著的下降,侵袭和迁移的细胞数量减少。

综上所述,该药可抑制Hela细胞的增殖、侵袭和迁移,在Western blot中通过Bax蛋白表达水平的上调,Bcl-2蛋白表达水平的下调来促进Hela细胞的凋亡,在临床应用前景上,盐酸药根碱作为潜在的抗宫颈癌药物提供了一定的科学依据。