越南非洲猪瘟疫苗NAVET-ASFVAC（ASFV-GΔI177L）研究现状及思考

戈胜强，徐天刚，尼 博，刘春菊，韩乃君，王晓华，郑 辉，王志亮

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.青岛市现代生物工程及动物疫病研究重点实验室，山东青岛 266032；3.农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室（南方），山东青岛 266032）

2023年7月24日，越南政府正式批准两款非洲猪瘟（ASF）疫苗在其全国范围内使用[1]。此次批准的两款疫苗为非洲猪瘟病毒（ASFV）基因缺失弱毒疫苗，分别为越南国家兽医联合股份公司（National Veterinary Joint Stock Company，NAVETCO）生产的NAVET-ASFVAC（ASFVG-ΔI177L）和AVAC越南股份有限公司生产的AVAC ASF LIVE（ASFV-G-ΔMGF）。此外，越南Dabaco集团联合股份公司研发的ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR株疫苗也正在进行最后的注册审批。这三款越南疫苗的种毒均为从美国引进的基因Ⅱ型缺失毒株，其中ASFV-G-ΔI177L引进越南时间最早（2020年9月），相关配套研究及公开报道信息最多。自2020年美国I177L基因缺失株（ASFV-G-ΔI177L）[2]公开报道，并将其授权越南进行临床研究以来，美国（部分联合越南研究机构）对该毒株进行了多方面评价，涉及毒株构建[2]、口鼻接种[3]、传代细胞系驯化[4]、越南地方品种猪评价[5]、水平传播/毒力返强评价[6]、种子批纯度验证[7]、大剂量长期观察[8]、细胞免疫影响[9]等。这些试验从各个方面证实了ASFV-G-ΔI177L基因缺失株具备较好的疫苗应用潜质，但在我国目前尚无材料进行全面介绍，为此就越南ASF疫苗（ASFV-G-ΔI177L）种毒的核心研究数据进行综述，以期为我国相关研究及政策制定提供参考。

1 I177L基因缺失株首次评价数据

2020年，Borca等[2]发表文章称ASFVI177L基因缺失株可对格鲁吉亚分离株（ASFV-G，基因II型）产生有效保护，这是目前为数不多的能对ASFV-G产生保护的试验性疫苗候选株，也是首个能诱导产生无排毒免疫（sterile immunity）的疫苗株。I177L基因位于ASFV-G基因组的第174 471和第175 004位核苷酸之间，编码177个氨基酸。I177L基因编码序列在大多数ASFV分离株中高度相似，推测其基因包含1个N端跨膜螺旋，表达的蛋白为晚期表达蛋白，其功能尚不明确。ASFV-G毒株敲除I177L基因后，其在原代细胞中的繁殖能力显著降低，其病毒复制水平也只有母本病毒的1/100～1/1 000。动物接种试验证实，不同剂量接种（102、104、106HAD50，肌肉注射，每组5只）后动物全部存活，接种后第12天所有猪只抗体转阳，28 d观察期内无任何体温反应和临床异常表现。ASFV-G-ΔI177L接种后病毒会在血液中持续存在，且病毒滴度与接种剂量呈一定正相关，但不同剂量接种猪存在一定差异，104和106HAD50接种组的病毒滴度（第4～7天）要普遍高于102HAD50接种组1 000～10 000倍，但仍低于ASFV-G野毒接种组。对ASFV-G-ΔI177L接种组中混养的空白对照猪/哨兵猪（sentinel animals）进行检测，结果在血液和第28天剖检的扁桃体和脾脏中均未检出病毒。

对ASFV-G-ΔI177L接种猪进行攻毒保护试验（ASFV-G，102HAD50，肌肉注射），结果所有猪只均存活，21 d观察期内无任何体温反应和临床异常表现。ASFV-G-ΔI177L接种组所有猪只的病毒血症均低于攻毒对照猪，且呈现逐渐下降直至消失的趋势。在攻毒后第4天采集所有接种试验猪的血液样品进行ASFV-G病毒检测，结果除102HAD50ASFV-G-ΔI177L接种组1头猪外，其余所有猪只的血液样品均检测不到ASFV-G病毒核酸。攻毒后第21天（试验观察结束）采集所有接种试验猪的扁桃体或脾脏，结果仅102HAD50ASFV-G-ΔI177L接种组同一头血液阳性猪的脾脏中检出ASFV-G核酸。以上数据说明，所有接种剂量大于104HAD50的试验猪和大多数102HAD50接种猪体内均没有强毒株（ASFV-G）复制迹象。这也是该疫苗被美国“寄予厚望”的最重要原因之一，即高剂量ASFV-GΔI177L接种猪可以从某种程度上清除强毒株感染。

2 口鼻接种评价

2021年4月，Borca等[3]对ASFV-G-ΔI177L减毒株的口鼻接种途径（106HAD50滴入鼻腔后部或舌根）和肌肉注射途径（102HAD50）进行了安全性和有效性评估及比较。结果表明：口鼻接种和肌肉注射的所有猪只均存活，28 d观察期内无任何体温反应和临床异常表现。口鼻接种组的病毒滴度较低，仅约是肌肉注射接种组的1/10 000；肌肉注射组的病毒血症水平在接种后第7天开始升高，第11～14天达到最高位（104～107HAD50/mL），而口鼻接种组的病毒血症水平一直较低，接种后第4～7天达到最高（102～104HAD50/mL），至第28天攻毒前仍保持在低于103HAD50/mL的水平。与之前研究相似，口鼻接种组和肌肉注射组的同群饲养空白猪样品（接种后第28天血液、扁桃体和脾脏）均为阴性，这表明ASFV-G-ΔI177L不论以何种方式接种，均不能排出足量的病毒感染同群猪。

接种后第28天攻毒（ASFV-G，102HAD50，肌肉注射）的结果显示，肌肉注射组和口鼻接种组猪均存活，21 d观察期内无任何体温反应和临床异常表现；病毒血症监测结果显示，口鼻接种猪攻毒后只有较低水平的病毒滴度（102.8HAD50/mL）。以上数据说明，经口鼻途径接种疫苗的安全性及免疫效果更好，其病毒血症水平比肌肉注射接种方式更低且能抵抗强毒株攻击。

3 越南地方品种猪安全性和效力评价

2021年9月，美国梅岛动物疫病中心（Plum Island Animal Disease Center）联合越南国家兽医联合股份公司（NAVETCO），评价了ASFV-GΔI177L疫苗候选株对越南地方品种芒菜杂交猪（Vietnamese Mongcai crossbred pigs，MC）的安全性，并在欧洲大约克-长白二元杂交猪（European Yorkshire and Landrace crossbreed，YL）和MC两个品种猪上进行了免疫攻毒保护试验[5]。结果表明：不同剂量（101、102、103、104HAD50，肌肉注射）ASFV-G-ΔI177L疫苗候选株接种的MC品种猪和大剂量（106HAD50，肌肉注射）接种的YL品种猪，均在28 d观察期内无任何体温反应和临床异常表现。101HAD50接种组只有2头猪有轻微的抗体反应，剩余3头猪无抗体反应；102HAD50接种的5头猪也只有轻微的抗体反应，而103和104HAD50接种组均有较强的抗体反应。攻毒（TTKN/ASFV/DN/2019，102HAD50，肌肉注射）结果显示：101HAD50接种组中有3头猪发病死亡，其余2头猪存活；102HAD50接种组中5头猪均存活，但2头猪出现一过性体温升高；103HAD50接种组除1头猪出现一过性体温升高外，其余猪只无任何临床症状，而104HAD50接种组均无任何临床症状。排毒检测结果显示，只有101HAD50接种组中存活的2头猪能检测到攻毒强毒株，其余接种组猪均未检出攻毒强毒株。

为进一步验证不同品种猪的安全性，将25头YL品种猪和22头MC品种猪各接种2次（102.6HAD50，肌肉注射，间隔2周），结果发现在28 d观察期内，除2头猪有2 d排软粪便，其余猪只均无任何临床异常[6]。

为进一步比较MC品种猪（20头）和YL品种猪（25头）的攻毒保护水平差异，对两组猪均统一接种102.6HAD50剂量的ASFV-G-ΔI177L。结果显示：第14天和21天的抗体阳性率，MC品种猪分别为30%和60%，而YL品种猪分别为46%和73%；接种后第28天攻毒（TTKN/ASFV/DN/2019，102HAD50，肌肉注射），发现所有接种猪（共45头）在21 d观察期内，除个别猪出现不到40 ℃的体温反应外，均无其他临床异常表现。以上数据说明，两个品种猪免疫接种ASFVG-ΔI177L（102.6HAD50剂量以上）后均安全，并能抵御越南流行强毒株攻毒，且未见显著差异。

4 不同品种猪攻毒保护起效时间评价

为评价ASFV-G-ΔI177L的免疫保护起效时间，美国梅岛动物疫病中心继续联合NAVETCO对不同组在接种（102.6HAD50，肌肉注射）后第14天（6头YL猪和12头MC猪），第21天（5头MC猪）和第28天（YL猪和MC猪各5头）进行攻毒试验（TTKN/ASFV/DN/2019，102HAD50，肌肉注射）[5]。结果显示：第14天攻毒组中，3头YL猪和6头MC猪存活（各占50%）；第21天和28天攻毒组中，所有猪只均存活且无任何体温反应和临床异常表现。这说明ASFV-G-ΔI177L接种（102.6HAD50，肌肉注射）后，第21天即可产生全面保护且对两个品种猪无显著差异。

5 水平传播评价

2022年4月，美国梅岛动物疫病中心继续联合NAVETCO，对ASFV-G-ΔI177L进行了更深入的安全性评价[6]。结果显示：4头接种猪（102.6HAD50，肌肉注射）和5头空白对照猪同圈饲养，28 d观察期内，所有猪无任何体温反应和临床异常表现；4头接种猪第7、14、21天血液中均有病毒（Ct最低为28.62），但到第28天时全部转为阴性；4头接种猪的鼻腔拭子从第14天开始部分出现阳性核酸，但第28天时只有1头猪阳性（Ct为32.78）；5头同群猪前21 d，血液和鼻腔拭子均为阴性，但第28天时有2头猪鼻腔拭子为阳性（Ct分别为36.00和36.86），血液样品仍为阴性。此外，5头同群猪在接种后49 d仍为抗体阴性。这说明在实验室环境下，同群猪未被接种猪（带毒/排毒）感染。

为验证临床状态下的病毒水平传播能力，将50头接种猪（102.6HAD50，肌肉注射，间隔3周接种2次）和10头空白对照猪同圈饲养，49 d观察期内，所有猪无临床异常表现；在第49天时，同群猪中有3头血液中有病毒核酸（Ct分别为37.29、36.90和21.14），且50%的猪抗体阳性（5/10）。这说明在临床环境下，ASFV-G-ΔI177L在一定程度上可通过水平传播感染同群猪，并进行病毒复制产生ASFV特异性抗体。此外，高病毒载量（Ct为21.14）的同群猪抗体为阴性，推测该猪仍处于感染早期，未来抗体可能会转阳。

6 超剂量接种安全性评价

为验证超剂量接种的安全性，美国梅岛动物疫病中心继续联合NAVETCO将14头猪接种10倍剂量（103.6HAD50），6头猪接种5倍剂量（103.3HAD50），12头猪单剂量接种2次（102.6HAD50，间隔2周）[6]，结果发现在15 d或28 d的观察期内，大部分猪临床表现正常，仅个别猪（每组1～2头）出现1～2 d的咳嗽、软粪便和轻微体温升高等。这说明该疫苗以10倍剂量接种仍然安全。

7 毒力返强评价

为评价ASFV-G-ΔI177L在猪体内连续传代后是否会发生毒力返强，美国梅岛动物疫病中心继续联合NAVETCO将ASFV-G-ΔI177L对实验猪连续感染5代（每代次3头猪）[6]。第一代猪接种（102.8HAD50，肌肉注射）后，第二代到第五代猪分别肌肉接种上一代第11和14天的1 mL血液（前期试验证实为病毒血症滴度最高时刻）并测定每代次猪第7、11、14、21和28天的病毒血症。结果显示：5代猪均未出现ASF特征性临床发病症状，采食量正常，对外部刺激保持警觉，只有个别猪出现咳嗽、软粪便和短暂体温升高等反应；但随着传代次数增加，病毒血症的滴度和阳性存留时间均呈明显增长趋势（表1）。以上数据说明，ASFV-GΔI177L在猪体内连续传5代仍有较稳定的安全表现，5个代次病毒的全基因测序也未发现重要的基因组变异，但病毒血症增高的潜在风险仍需进一步研究和评估。

表1 各代次病毒血症检测情况 单位：HAD50/mL

8 大剂量长期观察评价

为评价大剂量接种（106.0HAD50，肌肉注射）后，病毒在体内长时间的消长规律，Borca等[8]将ASFV-G-ΔI177L接种后分别观察90 d或180 d。结果显示：所有接种猪在观察期内无任何体温反应和临床异常表现，90 d和180 d剖检未观察到任何与ASF相关联的病变。病毒血症监测结果显示：90 d观察组（5头猪）中，第30天的病毒滴度为阴性至106.0HAD50/mL，第60天时只有1头猪病毒滴度为103.55HAD50/mL，其余均为阴性，至第90天时，所有猪检测均为阴性；相似的，180 d观察组（10头猪）中，病毒血症自第90天开始也全部变为阴性，直至试验结束。以上试验说明，大剂量接种ASFV-G-ΔI177L未出现临床异常现象，病毒血症期小于90 d。

9 有关思考

ASFV-G-ΔI177L是目前美国投入研究力量最多的ASF疫苗候选株。该毒株的一些生物学特点使得该毒株与其他在研的ASFV基因缺失弱毒株具备一定的差异。从“理想”的疫苗候选株评价角度考虑，该毒株“优点”是繁殖能力较母本强毒株低（约是母本的1/100～1/1 000），大剂量接种（104HAD50以上）可清除强毒株等，超剂量接种（10倍，103.6HAD50）依然安全，单次接种（102.6HAD50）最快在第21天产生全面保护，口鼻接种（106HAD50滴入鼻腔后部或舌根）也有攻毒保护能力等。但“缺点”是，接种后病毒血症滴度较高，超剂量接种（106.0HAD50）后存在长时间病毒血症（60 d），临床环境下存在水平传播能力，毒力返强试验中病毒血症增高等。此外，该毒株对于母猪（特别是妊娠母猪）、不同日龄靶动物以及野猪等还缺乏安全性评价，部分安全性评价中还缺乏组织病理、不同组织/淋巴结病毒载量等数据，对于是否能发生垂直传播、基因重组以及对基因I型ASFV的交叉保护能力等还缺乏评价。

ASFV-G-ΔI177L在实验室评价中未出现水平传播，但在临床环境评价中却证实其存在水平传播[6]，特别是1头同群猪在第49天时血液样本检测病毒Ct为21.14（滴度较高），结合该毒株在毒力返强试验中存在病毒血症增高以及猪只之间的平行数据有时存在一定的差异等现象，提示该毒株在临床应用中可能存在个别猪“效果不理想”进而诱发病毒持续变化，直至“免疫失败”或“临床副反应不可接受”等情况的发生，尤其是临床环境下存在水平传播的可能，因此应予以高度重视，持续开展系统的流行病学监测研究，及时掌握当前疫苗的实际使用效果，以便科学合理地管理使用疫苗。