福建省番鸭呼肠孤病毒的生物学特性及基因序列分析

朱小丽，陈小丽，程晓霞，林锋强，王 劭，江丹丹

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州 350013；2.三明市农业农村局，福建三明 365000）

番鸭呼肠孤病毒病从1997年开始在福建省莆田市、福州市等多地发生，临床上以肝、脾表面有多量针尖状白色坏死点为主要病理变化，俗称番鸭“肝白点病”[1-2]。该病主要发生于40日龄内番鸭，发病率可达30%～90%，病死率可达60%～80%[3-4]。2010年前，福建省为国内主要番鸭饲养区，番鸭呼肠孤病毒病在莆田市、漳州市等地多有发生，造成的危害尤其严重[3，5-7]。2010年后番鸭在江西、浙江和广东等省份的养殖规模不断扩大，番鸭呼肠孤病毒病流行范围随之越来越广。

番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）活疫苗2013年获得国家一类新兽药证书，2014年商品化疫苗上市。随着商品化疫苗的推广应用，番鸭呼肠孤病毒病的发病率和病死率大大降低。临床生产表明，MDRV活疫苗对番鸭呼肠孤病毒病的保护率可达90%以上[8-9]。然而小规模的番鸭呼肠孤病毒病疫情依然零星发生，其主要原因是很多散养户没有进行疫苗免疫[9]。为了解MDRV的分子流行病学特征，2021—2022年在福建省不同地区的番鸭发病饲养场收集临床样品进行病毒检测、病原分离鉴定和基因序列分析，来评价MDRV流行毒株的生物学特性，以期为该病防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂

80只1日龄雏番鸭和12日龄番鸭胚，购自漳州昌龙农牧有限公司；样品基因组提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit和RT-PCR试剂Onestep RT-PCR SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司；MDRV-MW9710株，由本实验室保存；所用引物，由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 样品来源

2021—2022年从福建省莆田、三明、漳州、南平等地收集15～20日龄番鸭疑似临床病例的肝脾组织病料样品125份。病例临床症状为采食量降低、精神沉郁、软脚等，剖检无包心包肝症状。

1.3 病原检测

MDRV检测引物，按照MDRV-MW9710株S4基因（KY580159）设计。上游引物MDRV-P1：CTACC TCAAA TGGTC GCAAT GGAG；下游引物MDRV-P2：GATCG TGTTG CCAAG TTAGA ACGAG（扩增长度500 bp，退火温度56 ℃）。将临床病料样品按照1:5比例磨成匀浆，取200 μL按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit说明书提取病毒RNA。将所得核酸通过One-step RT-PCR SuperMix进行MDRV RT-PCR检测。RT-PCR反应体系（50 μL）：病毒RNA 5 μL，2×TS Onestep Reaction Mix 25 μL，One-step Enzyme Mix 1 μL，上游和下游引物各1 μL，无核酶水17 μL。反应程序：45 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共36个循环；72 ℃延伸5 min。将所得产物在1%琼脂糖凝胶，120 V电泳20 min，在凝胶成像系统上观察结果。

1.4 病原分离

按照文献[10]方法，将MDRV阳性病料接种12日龄番鸭胚，收集48～96 h死亡胚尿囊液，提取DNA/RNA后进行MDRV、番鸭小鹅瘟病毒（MDGPV）、番鸭细小病毒（MDPV）、鸭新型呼肠孤病毒（NDRV）、鸭病毒性肝炎病毒（DHV）病原检测。

1.5 母源抗体检测

采集1日龄番鸭血液0.2 mL，分离血清后按照文献[9]中的方法检测中和抗体。

1.6 攻毒试验

将40只1日龄雏番鸭分成8组，每组5只，其中MDRV分离株攻毒组6组（6株分离毒株各1组）、MDRV-MW9710株攻毒组1组和空白对照组1组。攻毒组每只番鸭肌内注射0.2 mL MDRV尿囊液，空白对照组每只注射同剂量的Hanks液。攻毒后观察和记录番鸭的发病死亡情况。

1.7 免疫攻毒试验

将40只1日龄雏番鸭免疫MDRV活疫苗1羽份/只。7日龄时分成8组进行攻毒试验（攻毒剂量0.2 mL/只），每组5只，其中攻毒组7组（6组MDRV分离株和1组MDRV-MW9710毒株），对照组1组。攻毒后观察和记录番鸭发病死亡情况。

1.8 序列测定及进化树分析

按照MDRV-ZJ2000M株S4基因（KF306091）设计引物（上游引物MDRV-S4P1：GCTTTTTCCTTCTCCTTAGTG；下游引物MDRVS4P2：GATGAATAGCCCTTCCCC GCGG），扩增长度1 124 bp。取200 μL MDRV分离株尿囊液，按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit说明书提取病毒RNA。RT-PCR反应体系及反应程序同1.3。按照文献[10]进行PCR检测。将所得到的产物送北京擎科生物科技有限公司福州分公司进行序列测定以及同源性和进化树分析。

2 结果与分析

2.1 临床样品病原检测

收集的临床病料样品来自福建省4个地区的125家养殖场。115家养殖场在番鸭1日龄时免疫过MDRV活疫苗，在其病料样品中均未检测到MDRV强毒；10家在1日龄时没有免疫MDRV活疫苗，在其病料样品中检测出MDRV强毒6份，其中4份来自南平市，2份分别来自三明市和莆田市（表1）。结果表明，MDRV活疫苗能够有效预防MDRV感染。

表1 临床样品MDRV检测结果 单位：份

2.2 病毒分离及检测

在番鸭胚上将6份MDRV临床阳性病料进行传代，结果发现番鸭胚接种病料后均100%死亡，解剖发现胚体肝脏有白色坏死点。对相应尿囊液进行PCR检测，仅能检测到MDRV，其他病毒均为阴性（表2）。

表2 MDRV分离株尿囊液病毒检测结果

2.3 母源抗体检测及攻毒试验

80只番鸭1日龄血清中和抗体效价检测结果显示，63份血清效价为20，17份血清效价为2-1。6株MDRV攻毒4～5 d后，攻毒组番鸭开始发病，7～14日龄多发，各组发病率为60%～100%，主要表现为拉稀、不愿站立、少食。番鸭死亡时间为攻毒后7～14 d（7～14日龄），死亡率为40%～60%（表3）。对死亡番鸭解剖发现，其肝脏和脾脏均有大量灰白色针尖状坏死点。20日龄后，存活番鸭临床症状逐渐消失，但生长缓慢，变成僵鸭。6组分离株攻毒组的发病率、病死率和临床症状均与MDRVVMW9710株攻毒组相近（表3）。

表3 番鸭攻毒试验结果 单位：只

2.4 免疫攻毒试验

1日龄番鸭免疫MDRV活疫苗后，7日龄时使用6株分离株和MW9710株分别进行攻毒试验，结果各组均未见发病和死亡现象（表4），表明MDRV活疫苗能够抵抗不同MDRV分离株的感染。

表4 番鸭免疫攻毒试验结果 单位：只

2.5 序列测定及进化树分析

6株MDRV分离株均能扩增出1 124 bp条带（图1）。同源性分析结果（图2）显示：6株MDRV分离株的S4基因核苷酸序列与MDRVMW9710株一致。6株MDRV分离株之间的同源性为99.3%～99.7%，与国内MW9710株和ZJ2000M株同源性分别为98.9%～99.2%和96.1%～96.5%，与MDRV国外分离株89026和D2044株同源性分别为89.9%～90.6%和86.9%～87.2%。结果表明，2021—2022年福建省流行的MDRV毒株与国内流行株同源性较近，而与国外流行株同源性较远。进化树分析结果（图3）显示：6株分离株与MDRVMW9710株属于同一分支，而与国外分离株属于不同分支。

图1 MDRV分离株S4基因扩增图谱

图2 6株MDRV分离株与参考株同源性分析结果

图3 6株MDRV分离株进化树分析结果

3 讨论

番鸭呼肠孤病毒病自1997年在福建省莆田市和福州市大规模暴发后，逐渐在广东、浙江等省份蔓延开来，造成番鸭大量死亡，经济损失极为严重[3]。由于当时没有特效药物和疫苗，疫情难以控制[1]，给番鸭养殖业带来巨大损失，导致鸭农饲养番鸭信心不足[5，7]。

目前福建省番鸭饲养区主要集中在漳州市、三明市、莆田市、南平市等地。这几个地区的番鸭总饲养量占全省90%以上。2014年MDRV活疫苗被成功研制上市后，该病的大规模暴发大大减少。临床生产证实，MDRV活疫苗免疫对MDRV感染的保护率可达90%以上[8-10]。本研究发现，目前福建省番鸭群中依然存在MDRV感染，但其主要散发于未免疫MDRV疫苗的鸭群，流行毒株与国内早期流行毒株同源性较高。

MDRV的S4基因序列在整个基因组中变异程度最大，其编码的σC蛋白是病毒外壳上一种结构蛋白，相对分子质量最小，其功能是结合细胞，启动病毒感染。σC蛋白氨基酸序列38～72位存在一个卷曲螺旋（coiled-coil）结构，它与N末端的疏水性氨基酸形成一个具有锚定功能的纤维性尾部，通过识别宿主细胞启动病毒感染[11-14]。6株分离株的纤维性尾部高度保守，与1997年流行毒株MDRV-MW9710株同源性为98.6%～99.4%，存在变异的可能。进化树分析发现，6株分离株与MDRV-MW9710株属于同一分支，而与国外分离株属于不同分支。

综上，MDRV感染在福建省未免疫番鸭群中依然存在，流行毒株的生物学特性和基因组特性较为稳定，变异程度小，当前疫苗的可有效防控该病流行，因此要重视MDRV活疫苗的免疫。