MicroRNA-218、microRNA-193b在宫颈癌组织中的表达及与化疗耐药性的关系*

吴玲姣，邓洁，徐瑶，彭聪，徐蕾

（成都医学院第一附属医院 妇科，四川 成都 610500）

宫颈癌是全球女性癌症死亡的第四大原因，是目前影响全球女性健康的重要难题[1]。数据调查显示，全球每年约50万宫颈癌新发病例，我国每年宫颈癌新发病例约12万，其中4.8万患者死于宫颈癌[2]。外科手术切除、辅助放化疗等综合治疗是目前临床治疗宫颈癌的常用手段。国内外研究已证实化疗可显著改善宫颈癌患者临床疗效，使患者获得生存收益，但长期使用化疗药物可引起宫颈癌患者出现耐药现象，降低药物效价，最终导致宫颈癌细胞复发转移、病情进展，影响患者预后[3-4]。如何有效抑制化疗药物耐药已成为宫颈癌治疗的关键，深入探讨宫颈癌患者化疗耐药机制对于寻找宫颈癌治疗新手段具有重要意义。

近期研究发现化疗药物耐药性与microRNA（miRNA）调控的不同耐药基因表达的变化密切相关[5]。miRNA是一类小的非编码RNA，由19～29个核苷酸组成，通过碱基配对与靶基因结合调节基因表达，进而调节癌细胞的增殖、分化、凋亡、免疫反应逃避及化疗抗性等过程[6]。在宫颈癌中，已证实microRNA-218（miR-218）可作为肿瘤抑制因子调节与肿瘤进展和转移相关的细胞进程[7]；microRNA-193b（miR-193b）与肿瘤患者抗肿瘤药物顺铂敏感性密切相关[8]。目前关于miR-218、miR-193b在宫颈癌组织中的表达及其与化疗耐药性的关系尚缺乏报道，本研究探讨上述问题，以期为宫颈癌新的治疗靶点和预后标志物提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月—2023年1月成都医学院第一附属医院收治的101例行手术治疗的宫颈癌患者。纳入标准：①符合《子宫颈癌诊断与治疗指南（2021年版）》[9]中宫颈癌诊断标准；②首次确诊且行宫颈癌手术，术后行化疗；③年龄> 18岁。排除标准：①伴传染性疾病、血液系统疾病、免疫缺陷；②重要脏器功能障碍；③伴其他部位恶性肿瘤；④医患沟通障碍；⑤远处转移，伴性病、阴道炎等疾病；⑥术前血栓高度风险、术前行放化疗；⑦既往有子宫颈手术史；⑧伴手术禁忌证；⑨依从性差、自然失访。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者及家属签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 手术及取材 参照《子宫颈癌诊断与治疗指南（2021年版）》[9]，患者行手术治疗（包括保留生育功能手术、不保留生育功能手术、盆腔廓清术、腹主动脉±平羌淋巴结切除分期手术），切除原发病灶，术后行病理检查确认淋巴结转移情况，并给予化疗。将距肿瘤组织> 2 cm的组织作为癌旁组织。

1.2.2 癌组织化疗耐药性测定 将一部分癌组织标本消化制成细胞悬液后行化疗药物敏感性测定，将肿瘤组织剪成糊状碎块，消化酶消化，调整细胞密度为2×104个/mL；取单细胞悬液，接种于96孔培养板（180 μL/孔）中，分别加入药物终浓度为血浆峰值浓度的紫杉醇（58 mg/L）、顺铂（102 mg/L）、阿霉素（64 mg/L）、5-氟尿嘧啶（82 mg/L）、卡铂（43 mg/L），设5种测试浓度（测试药物的0.125、0.250、0.500、1.000、2.000倍），每个浓度设3个复孔。标本在37 ℃、5%二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养3 d，添加10μL 噻唑蓝（5 mg/mL）继续培养4 h后，每孔加入100μL盐酸异丙醇（0.04 N），静置10 min，用多功能微孔板检测仪检测，计算平均值。肿瘤细胞抑制率=[1-（X-Mi）/（Mo-Mi）]×100%（X、Mo、Mi为荧光强度抑制率），计算出杀伤50%肿瘤细胞所需药物浓度（IC50）和IC90，将IC90 > 100%测试药物浓度、IC50 > 25%测试药物浓度记为耐药。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应检测癌组织、癌旁组织miR-218、miR-193b表达 宫颈癌组织和癌旁组织在液氮中研碎，匀浆后使用QIACEN RNeasy Mini试剂盒（日本TaKaRa株式会社）分别提取癌及癌旁组织总RNA，分离miRNA，逆转录成cDNA，进行实时荧光定量聚合酶链反应，反应体系20 μL，反应条件：95 ℃预变性5 min，93 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，60 ℃拉伸30 s，共40个循环。内参U6，绘制熔解曲线，CT值为基础，2-ΔΔCT法计算miR-218、miR-193b相对表达量。见表1。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织、癌旁组织中miR-218、miR-193b相对表达量比较

癌组织、癌旁组织中miR-218、miR-193b相对表达量比较，差异均有统计学意义（P<0.05），癌组织中miR-218相对表达量低于癌旁组织，miR-193b相对表达量高于癌旁组织。见表2。

表2 癌组织、癌旁组织中miR-218、miR-193b相对表达量比较 （n =101，±s）

表2 癌组织、癌旁组织中miR-218、miR-193b相对表达量比较 （n =101，±s）

组织癌旁组织癌组织t 值P 值miR-218 8.04±1.23 3.82±0.47 20.294 0.000 miR-193b 0.47±0.09 2.01±0.38 38.127 0.000

2.2 宫颈鳞癌与宫颈腺癌患者常用化疗药物耐药情况比较

宫颈癌患者对体外化疗药物紫杉醇、顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡铂的耐药率分别为38.61%（39/101）、46.53%（47/101）、48.51%（49/101）、26.73%（27/101）、40.59%（41/101）。宫颈鳞癌与宫颈腺癌患者对体外化疗药物紫杉醇、顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡铂耐药率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3 宫颈鳞癌与宫颈腺癌患者常用化疗药物耐药情况 例（%）

2.3 不同耐药宫颈癌患者癌组织miR-218、miR-193b相对表达量比较

对体外化疗药物紫杉醇、顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡铂不同耐药情况的宫颈癌患者癌组织miR-218、miR-193b相对表达量比较，差异均有统计学意义（P<0.05），耐药患者癌组织中miR-218相对表达量均低于敏感患者，miR-193b相对表达量均高于敏感患者。见表4。

表4 不同耐药情况的宫颈癌患者癌组织miR-218、miR-193b相对表达量比较 （±s）

表4 不同耐药情况的宫颈癌患者癌组织miR-218、miR-193b相对表达量比较 （±s）

药物n t 值P 值t 值P 值紫杉醇2.456 0.016 3.002 0.003顺铂4.281 0.000 2.955 0.004阿霉素2.145 0.034 2.559 0.012 5-氟尿嘧啶2.309 0.023 2.278 0.025卡铂耐药情况耐药敏感耐药敏感耐药敏感耐药敏感耐药敏感39 62 47 54 49 52 27 74 41 60 miR-218 3.67±0.52 3.91±0.45 3.58±0.57 4.02±0.46 3.69±0.63 3.94±0.54 3.63±0.53 3.89±0.49 3.55±0.58 3.99±0.64 3.523 0.001 miR-193b 2.13±0.35 1.93±0.31 2.09±0.28 1.94±0.23 2.07±0.26 1.95±0.21 2.11±0.33 1.97±0.25 2.16±0.32 1.91±0.22 4.656 0.000

2.4 癌组织miR-218、miR-193b预测宫颈癌患者化疗耐药性的价值

ROC曲线分析结果显示，miR-218、miR-193b及两者联合预测宫颈癌患者化疗耐药性的敏感性分别为74.51%（95% CI：0.601，0.852）、70.59%（95% CI：0.560，0.821）、82.35%（95% CI：0.686，0.911），特异性分别为74.00%（95% CI：0.594，0.849）、78.00%（95%CI：0.637，0.880）、90.00%（95% CI：0.774，0.963），曲线下面积分别为0.754（95% CI：0.661，0.847）、0.743（95% CI：0.643，0.843）、0.890（95% CI：0.824，0.956）。见图1和表5。

图1 癌组织中miR-218、miR-193b表达预测宫颈癌患者化疗耐药性的ROC曲线

表5 癌组织中miR-218、miR-193b表达预测宫颈癌患者化疗耐药性的效能

3 讨论

宫颈癌的一线化疗药物多为铂类化合物、紫杉烷类等，顺铂的作用机制是基于链内和链间DNA交联的形成，顺铂可通过抑制DNA复制、RNA转录，最终导致癌细胞死亡，ABC家族的药物转运蛋白异常表达可造成顺铂回流增加，或有机阴离子转运蛋白表达减少，导致顺铂摄取减少，在细胞内顺铂又可以被含巯基的分子灭活，致使癌细胞对顺铂敏感性降低；紫杉醇可与β-微管蛋白亚基结合，从而稳定微管并阻断有丝分裂，细胞分裂受阻，从而导致癌细胞凋亡，紫杉醇耐药性中最重要的因素为ABC家族的药物转运蛋白的过度表达；此外致密的细胞结构和细胞外基质的丰富表达可限制化疗药物渗透到癌组织中；miRNA是调节基因表达的表观遗传机制，其耐药机制的产生均与miRNA调节的耐药基因表达改变有关[10]。宫颈癌中miRNA概况的体内外研究也表明，与耐药细胞系/组织相比，敏感细胞系/组织中miRNA的特征发生了明显变化[11]。miRNA可通过碱基配对与靶基因结合，转录后可调节多个基因的表达使靶基因降解或抑制靶基因翻译，miRNA能够通过识别目标mRNA的3'-非翻译区末端的非必要互补序列来与许多基因结合，控制基因表达并影响细胞代谢、增殖、DNA修复和细胞凋亡等过程。miRNA作为肿瘤抑制因子或致癌基因，调节大量基因和信号通路，可用于预测宫颈癌患者对化疗的反应，是预测治疗反应的合适生物标志物。

本研究结果显示，癌组织中miR-218相对表达量低于癌旁组织，miR-193b相对表达量高于癌旁组织，说明miR-218、miR-193b表达与宫颈癌发生关系密切。miRNA在许多细胞稳态功能中起着重要作用，在调节包括分化、血管生成和细胞周期在内的多种信号通路和生物过程中起核心作用。因此miRNA表达的改变与包括癌症在内的大量疾病有关。在癌细胞中，miRNA可作为抑癌基因或致癌基因，抑癌miRNA可通过负调控癌基因的表达来抑制肿瘤的发展，且在癌细胞中表达降低；致癌基因在癌细胞中表达上调，并通过抑癌基因的负调节促进肿瘤发展。

本研究结果显示，101例宫颈癌患者行体外化疗药物紫杉醇、顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶、卡铂的耐药率分别为38.61%、46.53%、48.51%、26.73%和40.59%，提示宫颈癌患者化疗耐药风险较高。越来越多的证据指出，miRNA在包括宫颈癌、卵巢癌在内的各种癌症的耐药性方面发挥着重要作用。耐药患者癌组织中miR-218相对表达量低于敏感患者，miR-193b相对表达量高于敏感患者，提示miR-218、miR-193b表达与宫颈癌患者化疗耐药有关。miR-218作为一种抑癌基因，上调miR-218表达可通过靶向下调蛋白磷酸酶甲酯e1、cyclin E2/smc4、磷脂酰胆碱酰基转移酶1进而抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。miR-218通过靶向Glut1k可增加膀胱癌对顺铂的敏感性[12]；miR-218-5p通过prkce/Mdr1轴调控胆囊癌对吉西他滨的敏感性[13]；miR-218通过调控ppp2r5a/Wnt信号通路促进口腔癌顺铂耐药[14]；miR-218-5p靶向EGln3抑制肺腺癌增殖、迁移和侵袭[15]。笔者推测miR-218可能通过多种信号通路途径调节宫颈癌患者基因和信号通路，进而介导化疗药物耐药性。GRABOWSKA等[16]研究显示，胶质母细胞肿瘤中miR-218的减少影响细胞外基质组成和细胞生物力特征，细胞外基质及胶质母肿瘤细胞刚性的变化可促进肿瘤细胞侵袭。CRUZ-de la ROSA等[11]研究显示，miR-218-5p/Runx2轴正向调节增殖与宫颈癌的不良预后相关。吴雄健等[17]研究显示，上调miR-218/Nedd9轴可诱导肝癌细胞凋亡，抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭。王旭等[18]研究指出，miR-218-5p可靶向血管内皮生长因子A基因促进宫颈癌HeLa细胞凋亡并抑制迁移。李正雄等[19]研究显示，长链非编码RNA铁蛋白重链1假基因3靶向miR-218促使其表达下调，可降低人肺癌顺铂耐药细胞对顺铂的化疗敏感性。

Polo样激酶1是细胞周期进程和细胞凋亡的关键调节剂，miR-193b-5p可通过靶向Polo 样激酶1 mRNA的3'-端非编码区，抑制Polo样激酶1表达，miR-193b-5p过表达可通过抑制Polo样激酶1诱导细胞凋亡，HapMap细胞系中，miR-193b过表达会增加卡铂和顺铂的耐药性[20]。Bcl-2家族蛋白介导的细胞凋亡在癌细胞获得性化疗耐药性中起关键作用，髓样细胞白血病-1是抗凋亡Bcl-2家族蛋白的重要成员，在预后不良的人类癌细胞中过表达，miR-193b可通过下调髓样细胞白血病-1来调节人乳腺癌细胞对多柔比星的耐药性[21]；笔者推测miR-193b可能通过调节宫颈癌患者基因和信号通路表达，进而介导化疗药物耐药性，但具体作用机制仍需后期进一步探讨。陈晨晨等[22]研究指出，miR-193b的表达与子宫内膜癌的发生、发展、转移和侵袭能力密切相关，且miR-193b可通过靶向于Mcl-1增强紫杉醇对子宫内膜癌细胞的杀伤效力。杜文霞等[23]研究指出，miR-193b在宫颈癌组织中呈高表达，沉默miR-193b可增加HeLa细胞对顺铂的敏感性，作用机制可能与磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路有关。miR-193b的表达与肿瘤直径以及淋巴结转移和远处转移的可能性有关[24]；外泌体miR-193b-3p通过靶向Zbtb7a促进精原细胞瘤中的顺铂敏感性[8]。ROC曲线结果显示，miR-218联合miR-193b预测宫颈癌患者化疗耐药性的敏感性、特异性、曲线下面积最高，提示miR-218联合miR-193b预测宫颈癌患者化疗耐药性效能良好。

综上所述，宫颈癌组织中miR-218表达低于癌旁组织、miR-193b表达高于癌旁组织，miR-218、miR-193b的表达水平与宫颈癌患者化疗耐药性有关，两者联合预测宫颈癌患者化疗耐药性效能良好。后期仍需更多临床与基础研究进一步验证本研究结论。