褪黑素通过降低circIL21R表达抑制结直肠癌细胞的恶性进展

宋雯 曾聪 李玉娟

直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是第三大最常见的癌症类型，也是导致癌症相关死亡的第二大原因［1］。结直肠癌的主要治疗方式包括手术切除、放化疗、放疗和靶向治疗。尽管这些治疗方法取得了一些进展，但CRC 的发病率仍在继续增加，患者的预后仍然令人沮丧，特别发生肿瘤远处转移的晚期CRC 患者［2］。因此，目前仍迫切需要寻找更多治疗方式以改善CRC 患者的生存预后。近年来多项研究表明褪黑素（Melatonin，Mel）的抗肿瘤特性，其中褪黑素可联合一线放化疗方案抑制肿瘤转移，提高CRC 患者的生存率［2，3］。但褪黑素在结直肠癌中发挥抗肿瘤作用的分子靶点仍需进一步探索，故本研究旨在探究褪黑素对结直肠癌细胞生物学行为的影响，并进一步阐明褪黑激素在CRC 发病和演变中抗肿瘤作用的分子机制，为褪黑素在结直肠癌患者中的临床治疗中提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料人结直肠癌细胞系（HCT116、SW620、SW480、HT29、RKO、DLD1）和正常人结肠上皮细胞系NCM460 来源于中国科学院细胞库。RPMI-1640 培 养 基，10%的 胎 牛 血 清（Gibco，USA），胰蛋白酶（新赛美公司），circIL21R 质粒（广州基旦公司），Trizol（Takara 公司），CCK-8 试剂盒（碧云天公司），EdU 试剂盒（碧云天公司），Transwell 小室（BD 公司），逆转录试剂盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒（Takara 公司），引物（生工生物工程科技（上海）有限公司）。

1.2 细胞培养细胞在RPMI-1640 培养基中，添加10%的胎牛血清，37℃，5%CO2培养。细胞融合达到80%以上后消化传代。将褪黑素浓度设定成50 uM、100 uM、200 uM 处理48 h 后继续后续细胞功能实验。

1.3 circIL21R高表达的结直肠肿瘤细胞模型胰酶消化细胞接种至6 孔板，分别将circIL21R 质粒及空载体感染HCT116 和SW620 细胞，设为circIL21R 组和Vector 组。感染48 h 后，更换10%胎牛血清的完全培养基，用qRT-PCR 实验检测感染效率。

1.4 qRT-PCR收集细胞并加入Trizol 后充分裂解细胞。加入1/5 体积氯仿震荡混匀，静止3-5 min。12，000 g/min，4℃离心15 min，收集上清后加入等体积量异丙醇，震荡混匀，室温静置10 min，12，000 g/min，4℃离心15 min 后，弃上清，沉淀用75%酒精洗涤，干燥后用适量DEPC 水溶解。cDNA 逆转录：使用逆转录试剂盒进行cDNA 反转录，反应条件为65℃10 min，55℃30 min，85℃5 min 和4℃5 min。qRT-PCR 检测：反应体系为2×PCR Premix10 μl，Primers 0.8 ul，cDNA 1 ul，H20 补足体积20 μl；反应条件为95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s 读板，共40 个循环。hsa_circ_0038728引物F：5’-CTGAGAGCAGCTGGGGCT-3’，R：5’-TCTTGCCAGGTAAGGGTGAG - 3’ 。 hsa_circ_0002319 引物F：5’-TCCCTCACCAGCTGTATTCAT-3’，R：5’-GGGGTGAAGCATGACCTTTG-3’。以GAPDH 为内参，使用2-△△Ct法分析目的基因的相对表达量。

1.5 CCK-8 实验检测细胞活性将细胞（5×103/孔）接种于96 孔板中，培养24 h，对每个孔分别进行换液处理，再加入10 ul 的CCK-8 染色液，并在培养箱内孵育120 min。在酶标仪中检测450nm 处的吸光值（OD），并进行分析。

1.6 EdU 实验检测细胞增殖能力将细胞（5000/孔）接种于96 孔板中过夜。将25 μMEdU 溶液加入细胞中，37℃孵育2 小时。4%多聚甲醛固定细胞15 min，EdU 反 应 液 进 行EdU 染 色，Hoechst 33342 进行细胞核染色。Image J 法计算细胞增殖率。

1.7 Transwell 迁移实验检测细胞迁移能力以无血清培养基将细胞（2×105/200 ul）接种在无铺基质胶的上室，下室加入20%胎牛血清的完全培养基。在37℃孵育48 h 后，4%多聚甲醛固定、结晶紫染色，在显微镜下观察记录。

1.8 统计学方法使用SPSS22.0 软件进行统计学分析，采用单因素方差分析检验对服从正态分布的计量资料进行分析，组间的差异采用Tukey 法进行两两比较。实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 褪黑素处理可抑制结直肠癌细胞的活性、增殖和迁移CCK-8 实验结果显示HCT116 和SW620经褪黑素处理后细胞活性下降，且与褪黑素的浓度相关，后续实验选取200 uM 作为褪黑素的处理浓度（图1A），EdU 实验结果显示经褪黑素处理后，HCT116 和SW620 细胞增殖能力明显下降（图1B），同样Transwell 实验结果显示结直肠癌细胞系的迁移能力在经褪黑素处理后也明显下降（图1C）。

2.2 褪黑素可降低结直肠癌细胞中高表达的circIL21R为了确定与结直肠癌进展相关的环状circRNA，我们从GEO 数据库下载了GSE121895、GSE126094 和GSE172229，其中，hsa_circ_0038728（circIL21R）和hsa_circ_0002319 在所有这些数据集中都表达（图2A）。通过qRT-PCR 实验发现circIL21R 在结直肠癌组织和结直肠癌细胞系中的表达均上调（图2B，C 和D）。并且，我们发现在HCT116 和SW620 细胞系中褪黑素可降低circIL21R 的表达（图2E）。

2.3 circIL21R 可逆转褪黑素对结直肠癌细胞的抗肿瘤作用为了进一步验证circIL21R 是否在褪黑素抑制结直肠癌细胞的活性、增殖及迁移能力中发挥作用，首先我们在结直肠癌细胞系转染circIL21R 的质粒（图3A），随后再次通过CCK-8、EdU、Transwell 实验，我们发现在过表达circIL21R后，褪黑素对结直肠癌细胞的活性、增殖、迁移能力的抑制作用均被逆转（图3B，C 和D）。

图1 褪黑素处理抑制结直肠癌细胞的活性、增殖和迁移 A.CCK-8 实验检测不同浓度下褪黑素对结直肠癌细胞活性的影响。B.EdU 实验检测褪黑素对结直肠癌细胞增殖能力的影响。C.Transwell 实验检测褪黑素对结直肠癌细胞迁移能力的影响。注：**P＜0.01，***P＜0.001。

3 讨 论

褪黑激素是松果腺分泌的一种天然激素，可调控睡眠-觉醒和昼夜节律，同时也具有抗炎，抗氧化和免疫调节等作用［4］。越来越多的证据指出褪黑素在癌症的发生、发展和转移阶段表现出抑癌特征［5］。研究表明褪黑素可通过抗炎、免疫调节、调节自噬、抑制糖酵解等多种机制抑制结直肠癌的恶性进展［3，6］。

图2 褪黑素抑制结直肠癌细胞中circIL21R 的表达 A.GEO 数据集展示。B.qRT-PCR 检测结直肠癌组织中circRNA 的表达。C.qRTPCR 检测结直肠癌细胞系中circIL21R 的表达。D.qRT-PCR 检测60 对结直肠癌组织中circIL21R 的表达。E.qRT-PCR 检测褪黑素对结直肠癌细胞circIL21R 的影响。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类没有5’和3’端形成共价闭环结构的非编码RNA。异常表达的circRNAs 可调控肿瘤细胞凋亡、细胞周期、增殖和转移，其中circRNA 在结直肠癌的远处转移、化疗耐药及免疫逃逸中发挥至关重要的作用［7］。研究发现褪黑激素可通过调节hsa_circ_0017109/miR-135b-3p/TOX3 轴而抑制肺腺癌的进展［3］，而褪黑素是否通过影响circRNA 的表达而抑制结直肠癌的恶性进展尚未报道。在本研究中我们首先证实褪黑素可抑制结直肠癌细胞的活性、增殖和迁移能力，这与之前的研究结果相一致［4］。随后通过GEO 数据库聚焦于结直肠癌中高表达的circIL21R，并发现褪黑素可降低circIL21R的表达，因此，我们推测circIL21R 在褪黑素抑制结直肠癌细胞的恶性程度中发挥了重要的调控作用。随后我们构建了过表达circIL21R 的结直肠癌细胞系，通过细胞功能学实验发现过表达circIL21R 可降低褪黑素对结直肠癌细胞活性、增殖及迁移能力的抑制作用。我们的实验首次发现circIL21R 在结直肠癌中的促癌作用，并证实褪黑素可通过降低circIL21R 而发挥对结直肠癌细胞的抗肿瘤作用。

综上所述，本研究中阐明了褪黑素在结直肠癌细胞中具体的分子机制，将有助于临床研究人员开发新的标准治疗方案以及针对结直肠癌的预防策略，但今后仍需进一步深入研究褪黑素如何调控circIL21R 以及circIL21R 的下游调控网络。

图3 circIL21R 可逆转褪黑素对结直肠癌细胞的抗肿瘤作用 A.构建过表达circIL21R 的结直肠癌细胞系。B.CCK-8 实验检测circIL21R 对褪黑素抗结直肠癌细胞活性的影响。C.EdU 实验检测circIL21R 对褪黑素抗结直肠癌细胞增殖能力的影响。D.Transwell 实验检测circIL21R 对褪黑素抗结直肠癌细胞迁移能力的影响。注：**P＜0.01，***P＜0.001。