干扰NLRP3及NLRP12对IL-6诱导全身型幼年特发性关节炎滑膜成纤维细胞增殖影响及机制研究

谢颖 李丰 唐盈 程苏云 张松 韦茹 徐彩虹 曾华松

全身型幼年特发性关节炎（sJIA）为慢性关节炎及全身表现，如周期性发热、皮疹、肝脾、淋巴结肿大，及持续升高的炎症指标，常常伴有实质性的关节破坏，最终致残［1］。sJIA 的发病机制仍未明确，血清和滑膜高水平的IL-6 与sJIA 患者多个临床表现及实验室指标有关，拮抗IL-6 受体可显著抑制sJIA 进程［2］。IL-6 可诱导滑膜细胞变类风湿关节炎成纤维滑膜（RASF）细胞，形成滑膜炎，最终导致骨质破坏。

目前认为NLR 受体可促进炎症反应导致自身免疫性疾病发生，NLRP3突变后，会导致IL-1β持续分泌，将会导致自身炎症性疾病，如sJIA 的发生。我们前期［3］qPCR 发现活动期sJIA 患儿外周血NLRP3，NLRP12 mRNA 存在高表达现象，并且与凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Caspase-1）mRNA 表达及JIA 的疾病活动度呈现正相关，那么IL-6持续升高对NLRP3、NLRP12有怎样影响？我们将在下面研究进一步探讨。

1 临床资料

1.1 一般资料研究方案获得广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会批准（批字（2021）第010A01-1）。

1.2 实验步骤和方法（1）5、10 和50 μmol/L 的不同浓度IL-6 刺激RASF 及细胞培养；（2）si-NLRP12 及NLRP3 抑制剂转染及MMT 实验；（3）IL-6刺激及MMT 细胞增殖实验；（4）RNA 提取、逆转录及QPCR；（5）ELISA 测定IL-1，IL-6，IL-18，TNF-α浓度；

1.3 统计学处理采用SPSS13.0 进行统计分析，NLRP3，NLRP12，ASC，NF-κB mRNA 相对表达量用2-δδCT 表示，组间比较用非参数检验（Kruskal-Wallis 检验），IL-1、IL-18，TNF-ɑ 浓度比较采用数据处理应用统计学软件SPSS13.0。实验数据均以（±s）表示，用单因素方差分析比较组间及组内差别。

2 结 果

2.1 IL-6诱导RASF 增殖及对NLRP3、NLRP12影响 见表1-4。

表1 CCK-8 检测各个时间段不同浓度IL-6 刺激RASFs增殖的OD 值

表2 IL-6 对NLRP3、ASC、NLRP12 影响（2-ΔΔCT）［M（P25，P75）］

表3 转染后siRNA-1 和siRNA-2 组NLRP3 及NLRP12 mRNA（2-ΔΔCT）

2.2 抑 制NLRP3 及NLRP12 对IL-6 诱 导RASF增殖的影响 见表3。

2.3 抑 制NLRP3 及NLRP12 对IL-6 诱 导RASF细胞炎症通路及炎症因子影响见表5。

3 讨 论

sJIA 目前认为T 细胞与巨噬细胞被大量激活将产生过多的细胞因子，介导关节组织损伤，如IL-6，TNF-α 等，IL-6 可诱导滑膜成纤维细胞及关节软骨细胞合成前列腺素E2 及金属蛋白酶合成。我们用不同浓度（5、10 和50 μmol/L）的IL-6 刺激RASFs 后，RASF 数量随IL-6 浓度和刺激时间较对照剂组明显升高，提示IL-6 可促进RASF 细胞增殖（P＜0.05），同时TNF-a 明显升高，提示IL-6 为RASF细胞活化关键分子。同时，本实验也发现IL-6 可诱导RASF 中炎症小体NLRP3 的产生。NLRP3 是促进前炎症因子产生的重要胞内蛋白复合物，近年来NLRP3 在类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）中的研究成为了新的热点，研究表明NLRP3 炎症小体与RA 病情严重程度及动脉硬化进展有关［4］。NLRP3 基因多态性可能与RA 心血管事件的发生息息相关［5］。Mathews RJ 等［6］发现NLRP3 在RA 外周血单个核细胞中表达升高有统计学意义。我中心SJIA 之前有关治疗方案［7］的研究则通过使用IL-1β 受体拮抗剂治疗难治性的JIA，侧面说明了NLRP3 炎症小体在RA 发病中的地位。我们前期研究发现NLRP3 在JIA 活动组中高表达。RASF 异常增殖是RA 其中主要机制，那么阻断NLRP3 对IL-6 诱导的RASF 增殖有怎样影响呢？本研究通过使用siRNA 干扰NLRP3 表达，可以减少IL-6 诱导的RASF 增殖。研究表明IL-1 及IL-18 为NLRP3 活化后下游炎症因子，可促进sJIA的发生发展，本实验中在IL-6 刺激下RASF 细胞IL-1，IL-18 升高，提示IL-6 可能参与NLRP3 激活，敲降NLRP3mRNA 表达，可明显降低IL-6 诱导的RASF 中IL-1 及IL-18mRNA 表达，提示IL-6 可能通过NLRP3 促进IL-1 及IL-8 表达。

表4 转染NLRP3 及NLRP12 siRNA 在IL-6 不同浓度刺激后RASF 细胞NLRP3、NLRP12 的表达（2-δδCT）

表5 转染NLRP3 及NLRP12 siRNA 在IL-6（50 ug/ml）刺激后RASF 细胞培养液中IL-1、IL-18、TNF-ɑ 浓度（IU/ml）变化

NLRP12 为新近发现的炎症小体成员，我们前期研究发现，在JIA 外周血单核细胞中NLRP12 升高，但具体作用不明了。最近的一些研究将NLRP12 与炎症反应的负向调控也联系起来，本研究表明，IL-6 刺激RASF，qPCR 结果显示NLRP12 则无明显变化，而敲降NLRP12 mRNA，则促进IL-6诱导的RASF 细胞增殖，提示NLRP12 在RASF 细胞增殖起负性调节作用。

目前多认为核因子-κB 受体激活因子（receptor activator of NF-κB，RANK）/RANKL/骨保护（osteoprotegrin，OPG）系统是调节破骨细胞分化和功能最重要的传导通路，促炎细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-17 等在RA 的骨微环境中影响着骨的重建，对破骨细胞的分化起重要作用［8］，我们发现干扰NLRP3 及NLRP12 可对IL-6 诱导NF-κB 升高有不同程度的影响。

那么阻断IL-6 是否能影响NLRP3、NLRP12 表达呢？本研究发现使用IL-6受体阻断剂组IL-1、IL-18 浓度较对照组明显下降（P＜0.05）；IL-6 受体拮抗剂组中NLRP3、ASC mRNA 表达水平低于疾病对照组（P＜0.05）而NLRP12 则无明显变化（P＞0.05）；提示拮抗IL-6 刺激，可下调NLRP3 表达，而对NLRP12 无明显影响；

综上所述，本研究为IL-6 诱导RASF 细胞增殖机制的初步研究，NLRP3 的表达升高，NLRP12 减低可能是IL-6 诱导RASF 细胞增殖中重要的分子事件NLRP3及NLRP12可能分别通过正负调控NFκB 的表达来抑制IL-6 诱导的RASF 细胞增殖，但具体的过程和机制还有待深入探讨。