HPLC法测定藏药十六味杜鹃花丸中羟基红花黄色素A的含量

杨小兰，谢和兵,*，尼玛次仁，白玛旦增，姜少婷

（1. 安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230000；2. 江苏神猴医药研究有限公司，江苏 南通 226133；3. 西藏神猴药业有限责任公司，西藏 聂拉木 858300；4. 南京归禾至康生物医药科技有限公司，江苏 南京 210038）

十六味杜鹃花丸是由烈香杜鹃、石榴子、红花、石灰华，甘草、肉豆蔻、葡萄干、螃蟹、肉桂、木香、广枣、荜茇、肉桂、丁香、豆蔻和力嘎都等共十六味药材制成的藏药传统丸剂[1]，现行标准为1995年版《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药：第一册》（WS3-BC-0193-95）[2]，其质量标准中只有性状和烈香杜鹃药材的薄层定性鉴别，无成分的定量测定，质量控制水平较低。本文研究建立了高效液相色谱法（HPLC）测定十六味杜鹃花丸中红花色素A含量的方法，为该药品质量标准提升提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100液相色谱仪（美国安捷伦）；XSR205DU/AC梅特勒电子天平（梅特勒-托利多）；UC-250DE超声清洗器（上海微峰）；PHS-3C雷磁酸碱计（上海仪电）；TGL-16B高速离心机（常州中捷）。

1.2 试药

红花（批号：20200301），石榴子（批号：20200201），石灰华（批号：20200301），葡萄干（批号：200401），螃蟹（批号：210801），广枣（批号：20200301），荜茇（批号：20200301），力嘎都（批号：2 0 2 0 0 4 0 1），木香（批号：20200401） ，肉桂（批号：20200301）（西藏神猴药业）；甘草（批号：210901），沉香（批号：210801），丁香（批号：220228），豆蔻（批号：220228），烈香杜鹃（批号：211201），肉豆蔻（批号：210501）（安徽援康中药饮片）；药材经江苏神猴医药研究有限公司质检均符合法定标准。

羟基红花黄色素A（批号：111637-202111，含量96.8 %，中国食品药品检定研究院）；甲醇（批号：6808CU13，色谱纯），磷酸（批号：20210906，分析纯）、三乙胺（批号：C13683716，分析纯）（国药集团化学试剂公司）；水（娃哈哈纯净水）。十六味杜鹃花丸制剂由江苏神猴医药研究有限公司制剂实验室制备（批号：20220310，20220311，20220312，规格：每丸重0.5 g）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：UItimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：甲醇-0.7 %磷酸（三乙胺调节pH 6.0）（体积比27:73）；流速为1.0 ml/min；进样量为10 µl；检测波长为403 nm；柱温25 ℃。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取羟基红花黄色素A对照品10.09 mg，置入50 ml量瓶，加25 %甲醇溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度为195.3424 μg/g的对照品储备液；取2 ml对照品储备液，置入10 ml量瓶，用25 %甲醇稀释至刻度，配制成质量浓度为39.0685 μg/ml的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取十六味杜鹃花丸（批号：20220310）适量，研细，过60目筛，精密称取粉末约2.5 g，置入150 ml具塞锥形瓶中，加入50 ml水，称定重量，加热回流提取60 min，静置冷却至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤纸抽滤，作为供试品储备液；精密量取续滤液5 ml，置10 ml量瓶中，用25 %甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按照处方比例配制缺红花药味的阴性样品，同2.2.2项下供试品溶液的制备方法制得。

2.3 专属性

精密量取阴性样品溶液，对照品溶液，供试品溶液各10 μl，按2.1项下的色谱条件进样，记录色谱图。结果表明，供试品和对照品溶液的保留时间一致且峰形对称，阴性对照在目标峰处无干扰，理论塔板数以羟基红花黄色素A计不低于8000，该方法的专属性良好。见图。

图1 羟基红花黄色素A专属性色谱图

2.4 线性范围考察

精密移取3，4，5，7.5，10 ml对照品储备液，分别置入25 ml量瓶，用25 %甲醇稀释至刻度，摇匀，即得线性对照品溶液1～5；取对照品储备液作为线性对照品溶液6。按2.1项下色谱条件分别测定线性对照品溶液1～6，记录色谱峰面积。以对照品溶液的质量浓度（μg/ml）为横坐标，以对照品溶液中羟基红花黄色素A的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果，线性回归方程为Y=29.9700X-15.3126（r=0.9996），表明羟基红花黄色素A在23.4411～195.3424 μg/ml的范围内有良好的线性关系。

2.5 检测限和定量限

取2.2.1项下对照品溶液适量，用25 %甲醇溶液逐级稀释后进样分析，测得羟基红花黄色素A的定量限（S/N=12.4）为 0.08 μg/ml；检测限（S/N=3.9）为 0.02 μg/ml。

2.6 精密度试验

取2.2.1项下制备好的对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续6次，记录峰面积，RSD为0.41 %（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.7 重复性试验

按2.2.2项下供试品溶液配制方法平行制备6份，按2.1项下色谱条件对6份供试品溶液进样测定，记录峰面积，按外标法以峰面积计算羟基红花黄色素A的含量，分别为1403.1175，1386.0262，1406.4210，1410.7525，1384.2949，1385.2870 μg/g，RSD为0.75 %（n=6），表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取十六味杜鹃花丸粉末2.0 g和羟基红花黄色素A对照品0.5 mg，置入150 ml具塞锥形瓶，再精密量取50 ml水，称定重量，加热回流提取60 min，静置冷却至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤纸抽滤，作为供试品储备液；精密量取续滤液5 ml，置入10 ml量瓶，用25 %甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。平行制备6份。按2.1项下色谱条件测定，记录色谱峰，按外标法计算回收率。结果，回收率在98.0 %～101.7 %之间，平均回收率为99.9 %，RSD为1.4 %（n=6），表明该方法准确度良好。结果见表1。

表1 羟基红花黄色素A加样回收率试验结果（n=6）

2.9 稳定性试验

精密移取2.2项下对照品溶液和供试品溶液，按照2.1项下色谱条件，于室温条件下，分别在0，2，4，6，8，10，12，14，24，30，72 h进行测定，记录色谱图，以峰面积考察供试品溶液和对照品溶液的稳定性。测得对照品峰面积和供试品峰面积的RSD分别为0.48 %（n=11），0.37 %（n=11），表明对照品溶液和供试品溶液在72 h内稳定性良好。

2.10 耐用性

按2.1项下色谱条件，单因素变化检测波长±2 nm、流速±0.2 ml/min、柱温±2 ℃、有机相比例±2 %、0.7 %磷酸pH±0.2，并更换ShimNex CS C18色谱柱[4.6 mm×250 mm，5 µm，岛津（上海）]，羟基红花黄色素A含量的RSD均小于2.0 %，表明此法在单因素变化条件下的耐用性良好。

2.11 中间精密度

精密吸取2.2项下的对照品和供试品适量，在不同分析人员，不同高效液相色谱仪和不同工作日的条件下按2.7项方法进行检测并记录羟基红花黄色素A化合物的峰面积，结果表明，两位分析人员所得的12份溶液中羟基红花黄色素A含量RSD为1.78 %。表明此法的精密度良好。

2.12 样品的含量测定

取批号为20220310，20220311，20220312的十六味杜鹃花丸样品，每批各2份，按照2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件记录峰面积，按外标法以峰面积计算，3批样品羟基红花黄色素A含量分别为1407.9624， 1378.7066，1394.2544 µg/g。

3 讨论

3.1 色谱条件的研究

3.1.1 检测波长的选择 本实验配制的39.0685 μg/ml的羟基红花黄色素A 对照品溶液，在 200～600 nm波长内进行全扫描，结果表明，羟基红花黄色素A在403 nm处有较强的可见光吸收，因此，本实验选择403 nm进行测定。

3.1.2 流动相、柱温的选择 本实验研究参考2020年版《中国药典》一部“红花”含量测定项下羟基红花黄色素A的测定方法，以甲醇-乙腈-0.7 %磷酸（体积比26:2:72）为流动相，结果表明，目标峰羟基红花黄色素A峰形不对称，拖尾因子有逐渐偏大的趋势。参考文献[3]调节流动相pH，pH 6.0时，目标峰型对称性最佳，但目标峰处仍有干扰、分离度不佳的问题。在此基础上，参考文献[4-15]，以分离度、耐用性为评价指标，研究调节柱温和流动相的组成、比例，结果表明，柱温25 ℃时，流动相为甲醇-0.7 %磷酸（体积比27:73），目标峰的分离度最佳。

3.2 供试品的处理研究

针对红花色素A的理化性质[10-11]，考察供试品的提取方式、提取溶剂。结果表明，水回流提取羟基红花黄色素A含量更高，峰形更好，理论塔板数和拖尾因子均达到理想效果，且无干扰；加水量与羟基红花色素A的得率呈正相关，当加水量为供试品重量的20倍及以上时，羟基红花黄色素A的得率无显著性差异。因此，最终优选的供试品处理方法为加水20倍，加热回流提取1 h，提取一次即可。

3.3 其他

羟基红花色素A是红花药材中的主要有效成分，本实验系统研究制定了十六味杜鹃花丸中羟基红花色素A的定量检测方法，提高了产品的质控水平，但十六味杜鹃花丸中含有大量含挥发性成分的药材，针对挥发性有效成分的定量研究尚需进一步的研究。