周茂东,李小飞,刘思光,李铁健,张贵民*
(1. 鲁南制药集团有限公司,山东 临沂 276000;2. 国家手性制药工程技术研究中心,山东 临沂 276000)
邻氟甲苯,是一种无色液体,常被用作医药、农药有机合成中间体[1-3],结构见图1。目前邻氟甲苯的合成工艺,大多数以邻甲苯胺为起始物料[4-5],经过一系列反应得到邻氟甲苯。如果邻甲苯胺中有间甲苯胺、对甲苯胺,合成过程中可能产生其同分异构体间氟甲苯和对氟甲苯,其结构见图1。
图1 氟甲苯系列化合物结构
原料药中的杂质与药品的质量紧密相关[6-9],邻氟甲苯作为医药有机合成中间体,其中的杂质同样影响原料药的质量,为了保证原料药的质量,需严格控制其中的杂质。由于邻氟甲苯、间氟甲苯、对氟甲苯三者互为同分异构体,其物理化学性质十分接近,因此分离和检测有一定难度。目前未检索到关于这3种化合物分析检测的文献,为了有效控制邻氟甲苯的质量,本研究建立了气相色谱法分离邻氟甲苯同分异构体的方法,为此类化合物的分离和检测提供参考。
Agilent GC 7890B气相色谱仪(配备FID检测器,美国安捷伦公司);MS204TS/02型电子分析天平(Mettler Toledo公司);SH-Rtx-225(30 m×0.32 mm,0.5 μm)色谱柱(日本岛津公司)。
间氟甲苯对照品(广州隽沐生物科技股份有限公司,批号:DM21092711,含量:99.9 %);对氟甲苯对照品(广州佳途,批号:0414-RB-0038,含量:98.2 %);邻氟甲苯(上海派沃蚨,批号:PWF2021102601);甲醇(Merck,批号:I1148507118)。
色谱柱:SH-Rtx-225 (30 m×0.32 mm,0.5 μm);升温程序:起始温度为45 ℃,保持15 min,以20 ℃/min升至200 ℃,保持5 min;进样口温度:200 ℃;氢火焰离子化检测器温度:250 ℃;空气流量:400 ml/min;氢气流量:40 ml/min;尾吹气(N2)流量:30 ml/min;分流比为20:1;载气(N2)流量:1.0 ml/min;进样量:1 μl。在该色谱条件下,分离效果见图2。
图2 GC色谱图
2.2.1 空白溶剂 甲醇作为空白溶液。
2.2.2 对照品储备液和对照品溶液 分别称取间氟甲苯和对氟甲苯各约10 mg,分别置入10 ml量瓶,用溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀,分别作为储备液;精密量取上述对照品储备液各2 ml,置入同一50 ml量瓶,用溶剂稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液 称取邻氟甲苯约200 mg,置入10 ml量瓶,用溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。
2.2.4 测试溶液 称取邻氟甲苯约200 mg,置入10 ml量瓶,用对照品溶液稀释至刻度,摇匀,作为测试溶液。
2.3.1 检测限和定量限 分别取2.2.3项供试品溶液,2.2.2项间氟甲苯和对氟甲苯对照品储备液,采用加溶剂逐步稀释法,以S/N≥10时的浓度作为定量限浓度;以S/N≥3时的浓度作为检测限浓度。结果表明,邻氟甲苯,间氟甲苯及对氟甲苯的定量限浓度分别为5.030,5.195,4.596 μg/ml;检测限浓度分别为1.677,1.732,1.532 μg/ml。
2.3.2 线性与范围 称取邻氟甲苯约400 mg,置入10 ml量瓶,精密加入2.2.2项间氟甲苯和对氟甲苯对照品储备液各800 μl,用溶剂稀释至刻度,摇匀,作为200 %线性储备液;依次稀释200 %线性储备液至限度浓度的20 %,40 %,60 %,80 %,100 %和150 %,作为线性与范围溶液2~7,定量限溶液作为线性与范围溶液1。进样分析,以峰面积(A)为纵坐标,浓度(C)为横坐标,绘制线性回归方程,结果见表1。
表1 线性与范围试验结果
2.3.3 进样精密度 按2.2项方法,配制对照品溶液,连续进样6针。间氟甲苯和对氟甲苯峰面积的RSD分别为3.8 %和2.8 %,表明仪器精密度良好。
2.3.4 重复性 按2.2项方法,平行配制6份测试溶液,测得6份间氟甲苯和对氟甲苯含量的RSD分别为1.8 %和2.2 %。
2.3.5 中间精密度 按重复性试验,计算不同分析人员、不同分析仪器和不同时间测定6份测试溶液所得结果。结果12份间氟甲苯和对氟甲苯含量的RSD分别为1.7 %和2.7 %。表明本法精密度良好。
2.3.6 回收率 按2.2项方法,配制间氟甲苯和对氟甲苯浓度为40 μg/ml混合溶液,作为对照品溶液;配制邻氟甲苯浓度为20 mg/ml溶液,作为供试品溶液;同时配制含邻氟甲苯20 mg/ml,间氟甲苯和对氟甲苯均为20 μg/ml混合溶液,作为50 %测试溶液;含邻氟甲苯20 mg/ml,间氟甲苯和对氟甲苯均为40 μg/ml混合溶液,作为100 %测试溶液;含邻氟甲苯20 mg/ml,间氟甲苯和对氟甲苯均为60 μg/ml混合溶液,作为150 %测试溶液。取上述溶液进样分析并计算回收率。结果见表2,间氟甲苯和对氟甲苯的平均回收率分别为107.35 %,98.14 %;回收率的RSD分别为3.5 %,2.5 %;表明本法的准确度良好。
表2 回收率试验结果
2.3.7 耐用性 按2.2.4项方法配制含邻氟甲苯20 mg/ml,间氟甲苯和对氟甲苯均为40 μg/ml的混合溶液(测试溶液)。分别于标准条件及分别改变进样口温度(±10 ℃)、流速(±0.1 ml/min)、升温速率(±5 ℃/min)的条件下,取以上溶液进样分析,邻氟甲苯、间氟甲苯、对氟甲苯三者间的分离度良好,最小为1.22,表明本法的耐用性良好。
由于邻氟甲苯,间氟甲苯及对氟甲苯的物理化学性质相似,沸点相近,试验中筛选不同的毛细管柱。在选择DB-WAX柱时,邻氟甲苯、间氟甲苯、对氟甲苯有分离趋势,但不能完全分离。在选择ZB-50柱时,邻氟甲苯、间氟甲苯、对氟甲苯完全重合,不能分离。使用SH-Rtx-225柱时,邻氟甲苯、间氟甲苯、对氟甲苯三者间分离度较好,峰形较好,灵敏度高,适合对邻氟甲苯同分异构体的分离和检测。
本法采用气相色谱法对邻氟甲苯的同分异构体进行分离和检测,方法简单实用,操作方便,准确性高。本研究为此类化合物的分离和检测提供了良好的参考依据。