人参多糖成分的含量和指纹图谱研究

高 莹，王本伟，逯海燕，宋真真

（1. 济南市人民医院，山东 济南 271100；2. 山东安捷生物检测技术有限公司，山东 济南 250101；3. 山东省药学科学院 山东省生物药物重点实验室，山东 济南 250101）

人参为五加科植物人参（Panax ginsengC. A.Mey. ）的干燥根和根茎，始载于《神农本草经》，其味甘，微苦，微温，归脾，肺，心，肾经；具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智等功效[1]。人参的化学成分主要有人参皂苷、人参多糖、甾醇及其苷、蛋白质、黄酮类、矿物质和维生素等[2]。其中人参多糖是其最主要的药效成分之一，药理学研究表明，人参多糖有调节免疫、降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗氧化和抗衰老等作用[3-9]。由于单糖组分是多糖发挥药效的关键，因此单糖组分检测在人参多糖质量控制方面有重要作用。单糖极性较强，结构相近，且缺乏光学活性，因此为了改善其分离度和提高检测灵敏度，通常采用三氟乙酸（TFA）水解多糖后，加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）进行柱前衍生化，然后进行高效液相色谱法（HPLC）分析[10-13]。本研究采用快速溶剂萃取方法（ASE）提取人参多糖，然后采用TFA水解-PMP柱前衍生化对人参中多糖组成进行HPLC指纹图谱分析和相对含量研究，并对11批人参多糖进行聚类分析，为人参中多糖的质量控制研究提供参考。

1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪（HPLC，安捷伦），包括G1379B型脱气机，G1312B型二元输液泵，G1367E型自动进样器，G1316A型柱温箱，G1314F型VWD检测器及Chemstation数据采集软件；赛默飞Dionex™ ASE™ 350快速溶剂萃取仪（ASE350，赛默飞世尔）；电子天平（XSE 105DU，梅德勒托利多）；高速冷冻离心机（5810R，Eppendorf）；Milli-Q超纯水机（Advantage A10，默克化工）；恒温水浴锅（HH-4，常州欧邦电子）；涡旋仪[Vortex Genius 3，艾卡（广州）]。

半乳糖醛酸（批号：111646-201702，含量：95.1 %），葡萄糖（批号：110833-202109，含量：99.9 %），半乳糖（批号：100226-201807，含量：100 %）（中国食品药品检定研究院）；鼠李糖（批号：R108982，含量：99 %），阿拉伯糖（批号：A115318，含量：100 %）（上海阿拉丁）；TFA（批号：210231，色谱纯，Fisher scientific）；PMP（批号：P109105，含量：99 %，上海阿拉丁）；乙腈（批号：214451，色谱纯，Fisher scientific）；甲醇（批号：216565，色谱纯，Fisher scientific）；水，Advantage A10 Milli-Q超纯水机制备的超纯水；其他试剂为分析纯。11批人参药材购自吉林省（批号：HJ191001，HJ191021，HJ200911，HJ200918，HJ200925，BG-20-07-09，BG-20-10-03，BG-21-4-11，BG-21-4-12，BG-19-2-11，BG-19-4-10。编号分别为S1-S11）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液[0.1 mol/L，pH 6.7，19:81（V/V）]；柱温：30 ℃；检测波长：245 nm；流速：1.0 ml/min；进样体积：20 μl；分析时间：40 min。

2.2 对照品储备液配制

精密称取鼠李糖，半乳糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖适量分别置入10 ml量瓶，加超纯水稀释至刻度，得浓度均为2.0 mg/ml单糖对照品储备液。

2.3 人参多糖溶液制备

取本品粉末（20～40目）1.0 g，置入10 ml不锈钢萃取池，萃取池的下端加装纤维滤膜，设置萃取参数（提取温度：120 ℃；冲洗体积：70 %；压力：1500 Psi；循环次数：1次；静态萃取时间：6 min；氮气吹扫时间：1 min），用75 %乙醇萃取，萃取液置入25 ml量瓶，用无水乙醇定容至刻度后转移至离心管，2～8 ℃冰箱放置24 h后，4000 r/min离心20 min，弃去上清，沉淀加80 %乙醇洗涤，4000 r/min离心20 min，弃去上清，沉淀用无水乙醇洗涤，4000 r/min离心20 min，弃去上清，最后沉淀加水溶解并转移至5 ml量瓶定容，摇匀，即得人参多糖溶液。

2.4 人参多糖水解及衍生化

精密量取人参多糖溶液0.5 ml置入5 ml安剖瓶，加入1.0 ml 2 mol/L TFA，熔封后100 ℃水浴加热6 h，转移至蒸发皿中，加2 ml甲醇，蒸干，重复3次，以除去TFA。加入1 ml超纯水溶解，摇匀，取100 μl置入10 ml具塞玻璃管，加0.6 mol/L氢氧化钠溶液100 μl，0.5 mol/L PMP甲醇溶液200 μl，混匀，70 ℃水浴反应120 min；取出放冷，加200 μl的0.3 mol/L盐酸中和，然后加900 μl超纯水，加入1.5 ml氯仿萃取，4000 r/min离心10 min，弃氯仿相，依法萃取3次，再用0.5 ml超纯水洗涤玻璃管2次，合并水相，置入蒸发皿，50 ℃水浴条件下蒸干，残留物精密加入1 ml超纯水溶解，混匀，转移至1.5 ml离心管中，13200 r/min离心5 min，取上清，即得。

2.5 人参多糖指纹图谱的构建和评价

2.5.1 精密度 取人参药材粉末适量，按2.3项方法制备人参多糖溶液，然后按2.4项和2.1项条件，连续进样6次，记录色谱图。以葡萄糖峰为参照峰，考察各色谱峰的相对峰面积和相对保留时间的一致性。结果：各色谱峰相对保留时间的变异系数均小于0.9 %，相对峰面积的变异系数均小于1.7 %，表明仪器的精密度良好。

2.5.2 稳定性 取人参药材粉末适量，按2.3项制备人参多糖溶液，然后按2.4项和2.1项条件，分别于0，2，4，8，12，24 h进样分析，记录色谱图，以葡萄糖峰为参照峰，考察各色谱峰的相对峰面积和相对保留时间的一致性。结果：各色谱峰相对保留时间的变异系数均小于1.0 %，相对峰面积的变异系数均小于2.5 %。表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.5.3 重复性 取人参药材粉末6份，按2.3项制备人参多糖溶液，然后按2.4项和2.1项条件，进样分析，记录色谱图，以葡萄糖峰为参照峰，评价各色谱峰的相对峰面积和相对保留时间的一致性。结果：各色谱峰相对保留时间的变异系数均小于1.5 %，相对峰面积的变异系数均小于3.0 %，由于半乳糖醛酸在提取过程中容易降解，其相对峰面积的变异系数为6.5 %。

2.5.4 指纹图谱的建立及共有峰的确认 取单糖混合对照品溶液，进样分析，记录色谱图；取11批人参药材粉末，按2.3项制备人参多糖溶液，然后按2.4项和2.1项条件，进样分析，记录色谱图。混合对照品色谱图和供试品色谱图见图1。

图1 5种单糖的HPLC色谱图

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012年版）对11批不同人参多糖指纹图谱建立共有模式，做出对照指纹图谱。11批人参多糖的指纹图谱叠加见图2。

图2 11批人参多糖样品的 HPLC 指纹图谱

以葡萄糖色谱峰为参照，标定出5个共有峰，生成对照指纹图谱。经与对照品相比较，归属了5个单糖，确定2，3，4，5，6号共有峰分别为鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。与葡萄糖的相对保留时间分别为0.716，0.832，1.000，1.129，1.229。

2.6 聚类分析

以11批人参多糖样品的5个共有峰的相对峰面积为变量，采用组间对比法结合平方欧氏距离进行聚类分析。结果表明，11批人参多糖共聚为三大类：第一类为S1，S2，S3，S5，S7，S9，第二类为S4，S6，S11，第三类为S8和S10。

2.7 相似度计算

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版，国家药典委员会）对11批不同人参多糖建立对照指纹图谱，将11批人参多糖图谱与其进行比较，计算相似度。11批人参多糖的相似度均大于0.90，相似度计算结果见表1。

表1 人参多糖相似度计算结果

2.8 人参多糖中单糖成分的含量测定

2.8.1 线性关系考察 取单糖对照品储备液，用超纯水稀释成6个不同浓度的混合对照品溶液，取100 μl对照品溶液置入10 ml具塞玻璃管，加0.6 mol/L氢氧化钠溶液100 μl，0.5 mol/L PMP甲醇溶液200 μl，混匀，70 ℃水浴反应120 min；取出放冷，加200 μl的0.3 mol/L盐酸中和，然后加900 μl超纯水，加入1.5 ml氯仿涡旋，4000 r/min离心10 min，弃氯仿相，依法萃取3次，再用0.5 ml超纯水洗涤玻璃管2次，合并水相，置入蒸发皿，50 ℃水浴条件下蒸干，残留物精密加入1 ml超纯水溶解，混匀，转移至1.5 ml离心管中，13200 r/min离心5 min，取上清进样分析。以浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），进行线性回归分析。标准曲线方程见表2。

2.8.2 精密度 取人参药材粉末（S6）适量，按2.3项制备人参多糖溶液，然后按2.4项和2.1项条件，连续进样6次，记录峰面积，并计算峰面积的变异系数。结果表明，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面积的RSD分别为1.4 %，1.6 %，0.3 %，0.8 %，0.8 %，表明该仪器的精密度良好。

2.8.3 稳定性 取人参药材粉末（S6）适量，按2.3项制备人参多糖溶液，然后按2.4项和2.1项条件，分别于0，2，4，8，12，24 h进样分析，记录峰面积，并计算峰面积的变异系数。结果表明，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面积的RSD分别为1.8 %，2.5 %，1.1 %，1.0 %，1.7 %，表明供试品溶液衍生化后在室温条件下放置24 h稳定性良好。

2.8.4 重复性 取人参药材粉末（S6）6份，按2.3项制备人参多糖溶液，然后按2.4项和2.1项条件，进样分析，记录峰面积，并计算峰面积的变异系数。结果表明，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面积的RSD分别为2.8 %，6.5 %，2.4 %，2.9 %，2.4 %，表明本方法的重复性良好。

2.8.5 加样回收率 取已知含量的人参药材粉末（S6）6份，分别按已知含量相同的量加入单糖对照品，按2.3项制备人参多糖溶液，然后按2.4项和2.1项条件，进样分析，记录峰面积，并计算各单糖成分的回收率。结果表明鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的平均回收率分别为104.8 %，92.6 %，96.4 %，105.3 %，96.6 %，回收率的RSD分别为2.6 %，5.4 %，2.7 %，2.5 %，2.2 %，表明本方法的加样回收率良好。

2.8.6 含量测定 取11批人参药材粉末适量，按2.3项制备人参多糖溶液，然后按2.4项和2.1项条件，进样分析，测定不同样品中鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的含量。结果鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的含量分别为0.148，1.236，3.373，0.558，0.549 mg/g。含量测定结果见表3。

表3 人参多糖中单糖含量/mg·g-1（n=3）

3 讨论

3.1 水解条件的选择

多糖水解是检测单糖的关键步骤，硫酸水解法采用高浓度硫酸易导致多糖炭化，出现较多杂峰，低浓度硫酸水解效果较差，导致分析结果偏差。因此，采用TFA水解，并严格控制水解条件。

TFA的浓度分别考察了1，1.5，2，2.5，3 mol/L，水解时间分别考察了2，4，6，8，12 h，通过综合评价各单糖的峰面积及各单糖峰面积之和选择最佳水解条件。结果表明选择2 mol/L的TFA，水解6 h人参多糖基本水解完全，因此选择2 mol/L的TFA，水解6 h作为最终水解条件。

3.2 衍生化条件的选择

PMP是一种弱酸性的化合物，在碱性条件下可与还原糖的醛基定量反应，产生强烈的紫外吸收，而且糖链的其他部位不会被破坏，过量的试剂易于除去，衍生化产物非常稳定，无立体异构。本实验主要考察了衍生化时间和温度。

衍生化时间分别考察了0.5，1，2，3，4 h，衍生化温度分别考察了30，50，70，90 ℃，通过综合评价各单糖的峰面积及各单糖峰面积之和选择最佳衍生化条件。结果表明PMP在70 ℃衍生化2 h各单糖的峰面积最大，因此选择70 ℃，衍生化2 h作为最终衍生化条件。

3.3 指纹图谱及含量测定结果分析

中药指纹图谱的构建和评价对于提高中药材质量标准，促进中药现代化具有非常重要的意义。本研究建立了11批人参多糖的指纹图谱，通过分析发现，11批样品的相似度均大于0.90，表明不同批次的人参多糖化学组成基本相同。通过和对照品的色谱图比对，共确认了5种成分，分别为鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。为进一步比较不同批次人参药材的质量差异，本研究建立了鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖5种单糖成分的含量测定方法。含量测定结果表明葡萄糖的含量最高，约占5种单糖总含量的50 %以上，总体而言，不同批次的人参药材单糖含量基本一致，表明不同批次的人参药材质量稳定可控。

综上所述，本研究成功建立了人参多糖的指纹图谱，并测定了鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖5种单糖成分的含量，所建的方法具有分离效率高、分析时间短、准确度高、重复性好等特点。可用于人参多糖成分的质量控制。