超声辅助β-环糊精包合法提纯α-亚麻酸工艺研究

郝文来，郝健

（深圳市诚致生物开发有限公司，广东 深圳518000）

心血管疾病已经成为危害人类健康的重大疾病之一，甚至青少年的发病率也呈逐年增长趋势[1-3]。研究发现，α-亚麻酸和γ-亚麻酸在预防和治疗心血管疾病方面均有显著疗效，且无不良影响[4-5]；更有研究者发现α-亚麻酸的功效更佳[6]。针对α-亚麻酸，它对人体的健康起到很多重要作用：如提高学习记忆和智商水平；抑制化学致癌物生成，抑制癌细胞生长和代谢；降低胆固醇，使胆固醇在肝脏中减少积累；降低血脂，保护大脑和心脏；缓解紧张带来的应激反应；α-亚麻酸油具有食用性，且稳定无异味，食用过量无副作用，是优异的保健食品等[7]。集众多优点于一身的α-亚麻酸广泛存在于鱼类、藻类和植物中，大量存在于亚麻籽油内[8]。众多研究表明，亚麻籽油中含有超过质量分数80%的α-亚麻酸[9-11]。并且亚麻籽的种植范围广泛分布于国内外多个地区，是一种理想的α-亚麻酸提纯原料。

虽然α-亚麻酸是一种理想的有益于人体健康的营养成分，但其分子中含有3个双键，很容易被氧化，故对提取和纯化工艺的要求较高，所以通常以某种特定的工艺来提高高纯度α-亚麻酸的稳定性。常见的加工工艺有乙醇提取法、超临界CO2萃取法、分子蒸馏法、尿素包合法、超声波法和β-环糊精包合法等[12-16]。

刘金菊等将亚麻籽油甲酯化，然后利用分子蒸馏法对其中的α-亚麻酸进行分离纯化，在优化工艺条件下得到的α-亚麻酸的质量分数超过80%，提取率也将近80%[10]。冷榨和溶剂浸出工艺是常见的亚麻籽油的加工方法，刘末利用优化的超临界CO2萃取法，得到优化的亚麻籽油提纯工艺条件，此亚麻籽油中的α-亚麻酸相对质量分数也超过75%，加工效果远优于前2种工艺[17]。陈乐清等为了得到纯化的α-亚麻酸，以亚麻籽油为原料油，首先经过甲酯化，进一步通过分子蒸馏法达到目的，得到纯化的α-亚麻酸的质量分数可达到80.27%，提取率可达到76.20%[11]。林非凡等则从高血脂疾病的预防和治疗实验方面，对α-亚麻酸的医用效果进行评价，以亚麻籽油为原料油，使用β-环糊精包合法进行提纯，再进行小鼠的降血脂实验，结果表明，上述方法得到的α-亚麻酸预防和治疗高脂血症效果明显[18]。

研究以亚麻籽油为原料油，通过超声辅助β-环糊精包合法，进行亚麻籽游离脂肪酸的制备和亚麻籽β-环糊精包合，考察不同条件下α-亚麻酸提纯率，并得到优化的参数。

1 实验部分

1.1 材料与仪器设备

原料与试剂。α-亚麻酸标准品，甲醇，色谱纯；甲醇，石油醚，无水乙醇，氢氧化钾，盐酸溶液，无水硫酸钠，β-环糊精，分析纯；亚麻籽油，工业品。

仪器设备。恒温水浴锅，SHJ-A6；电热鼓风干燥箱，DHG-9070A；循环水式真空泵，SHZ-95B；旋转蒸发仪，R-1005；高效液相色谱仪，HPLC 1200；电子天平，MS204S；锥形瓶、烧杯等玻璃陶瓷仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 亚麻籽游离脂肪酸的制备

制备1 mol/L 的KOH-乙醇溶液，然后按照体积比1:5混合亚麻籽油与KOH-乙醇溶液，在80 ℃的恒温水浴锅中回流45 min，在冷却至室温的混合液中加入一定量的去离子水进行溶解，之后加入石油醚对其中不能皂化的部分萃取除去。将分层后的下层溶液用质量分数20%盐酸溶液进行酸化，调整溶液pH至2～3；再次加入石油醚，充分搅拌混合，将完全混合的溶液移至分液漏斗，充分静置待其分层。分层后，将上层的有机相溶液从分液漏斗的口倒出，对下层的溶剂继续使用石油醚连续萃取至少3 次，将多次的有机相合并待用。用质量分数5%的NaCl水溶液对有机相洗至中性，再加入无水硫酸钠脱除有机相中所含有的水分，通过55 ℃条件下旋蒸滤液，回收其中的石油醚，最终得到亚麻籽油的混合脂肪酸。

1.2.2 亚麻籽β-环糊精包合方法

称取适量的β-环糊精制成饱和溶液。称取适量的亚麻籽油和无水乙醇，按照质量比2:1 进行混合，迅速加入β-环糊精溶液，然后放置于搅拌装置上搅拌操作10 min，使其混合均匀，随后在一定温度下进行超声。超声时间根据实验目的设置，然后每隔10 min取下搅拌20 s。最后，超声结束放置于冰箱中（-15 ℃）冷冻24 h进行脱包合。

冷冻结束后，融化后的溶液连接真空泵及抽滤设备，将混合液抽滤处理，分离出其中的β-环糊精结晶包合物，得到剩余滤液；将一定量的石油醚加入到剩余滤液中，并用质量分数10%的盐酸调节滤液的pH至2～3，加入一定的去离子水，保证萃取充分；分层取出有机相，多次重复萃取过程，将得到的有机相合并。将合并的有机相用质量分数5%的NaCl多次清洗直至中性，用一定量的无水硫酸钠脱除去有机相残留的水分，在50 ℃条件下旋蒸回收有机相中的石油醚，最终获得较高含量的α-亚麻酸。

1.2.3 单因素实验

参照1.2.2 节中的实验方法，采用无水乙醇进行预处理，分别对β-环糊精溶液与脂肪酸的料液比、超声温度、超声时间变量因素进行实验研究，分析其单因素对α-亚麻酸提纯率的影响。

1.3 分析方法

1.3.1 仪器条件

色谱柱及其参数：C18色谱柱填料，250 mm×2.6 mm，填充颗粒直径5 μm。流动相参数：甲醇与质量分数1%乙酸溶液体积比为90:10，体积流量1 mL/min。色谱柱温度30 ℃，检测波长205 nm，进样量20 μL。

索福达M100蒸发光散射检测仪参数：载气体积流量2 L/min，漂移管温度75 ℃。

1.3.2α-亚麻酸标准曲线绘制

精确称取10 mgα-亚麻酸与10 mL 的容量瓶中，并用甲醇溶液定容质容量瓶刻度线，此时标准溶液α-亚麻酸的质量浓度为1 g/L。分别用移液枪移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0 mL标准α-亚麻酸溶液于10 mL的容量瓶中，然后用甲醇溶液定容至容量瓶刻度线，此时标准溶液α-亚麻酸溶液的质量浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3 g/L。

将标准溶液进行液相色谱测定，用α-亚麻酸的质量浓度（ρ）和α-亚麻酸色谱图峰面积（A）进行作图，通过Origin 9.1进行拟合，如图1所示。

图1 α-亚麻酸的质量浓度和峰面积的线性拟合Fig 1 Linear fitting of mass concentration and peak area of α-linolenic acid

由图1可得拟合方程为：A/(μV·s)=1.563ρ/(g·L-1)+2 687，R2=1.000。

1.3.3α-亚麻酸含量测定

使用梅特勒托利多分析天平称量待测样品0.1000 g，加入到100 mL锥形瓶中，加入30 mL浓度0.5 mol/L 的碱性甲醇溶液，充分摇匀，将锥形瓶密封；在60 ℃水浴锅添加下对混合液充分震荡40 min，保证其充分的混合。将锥形瓶取出，静置冷却至室温，滴加一定量的盐酸溶液调节至中性，将溶液整体转移至250 mL 容量瓶中，用色谱纯甲醇定容备用。移液管精确移取1.00 mL上述溶液至10 mL 容量瓶，再用色谱纯度甲醇定容。用10 mL注射器吸取一定量的溶液，通过过滤膜后将液体打入进样瓶。

在上述制定的色谱设备和参数条件下，对样品进行液相色谱测定和分析。

2 结果与讨论

2.1 原料预处理

为了更好的形成包合物，α-亚麻酸需要借助乙醇等有机溶剂才能完全溶解。在超声温度40 ℃、超声时间75 min、料液比（β-环糊精与亚麻籽油的体积比）14∶1条件下，考察原料预处理对提取的α-亚麻酸纯度的影响，结果如表1所示。

表1 原料预处理方式对α-亚麻酸纯度的影响Tab 1 Effect of raw material pretreatment onthe purity of α-linolenic acid

由表1可知，当加入无水乙醇作为溶剂后，α-亚麻酸的纯度明显提高。

2.2 料液比的影响

使用无水乙醇作为溶剂，在超声温度25 ℃、超声时间60 min条件下，考察β-环糊精用量对α-亚麻酸纯度的影响，结果如图2所示。

图2 料液比对α-亚麻酸提取率的影响Fig 2 Effcet of solid-liquid ratio on extraction rate of α-linolenic acid

由图2可知，随着料液比的增加，α-亚麻酸的提纯率先增加后减小，料液比为14∶1 时，α-亚麻酸的纯度最大，为质量分数75.9%。当β-环糊精用量过量后会导致脱包后的杂质与α-亚麻酸混合，从而降低α-亚麻酸的纯度。

2.3 超声时间的影响

使用无水乙醇作为溶剂，超声时间60 min、料液比为14∶1 条件下，考察不同超声时间对α-亚麻酸提纯率的影响，结果如图3所示。

图3 超声时间对α-亚麻酸纯度的影响Fig 3 Effect of ultrasonic time on the purity ofα-linolenic acid

由图3可知，随着超声时间的增加，α-亚麻酸的纯度先增加后减小。超声时间为75 min时，α-亚麻酸的纯度最大，质量分数为74.3%。超声能增加分子运动，随着超声时间增加，β-环糊精的包和效果增加，但超声时间进一步增加会导致β-环糊精包和腔破裂，从而降低α-亚麻酸的纯度。

2.4 超声温度的影响

使用无水乙醇作为溶剂，超声时间75 min、料液比为14:1条件下，考察不同超声温对α-亚麻酸纯度的影响，结果如图4所示。

图4 不同超声温度对α-亚麻酸纯度的影响Fig 4 Effect of different ultrasonic temperature on the purity of α-linolenic acid

由图4可知，随着超声温度增加，α-亚麻酸的纯度先增加后减小。超声温度40 ℃时，α-亚麻酸的纯度最大，质量分数为78.2%。在一定程度上，温度升高增加了分子运动，促进了包合过程；但温度过高时，会导致β-环糊精包和腔破裂，从而降低α-亚麻酸的纯度。

3 结 论

以亚麻籽油为原料油，β-环糊精作为包合剂，研究了原料预处理、料液比、超声温度、超声时间对α-亚麻酸纯度的影响。结果表明，采用无水乙醇作为溶剂可以提高α-亚麻酸的纯度，当料液比、超声温度、超声时间分别为14∶1、40 ℃、75 min时，α-亚麻酸的纯度最大，质量分数可达78%。