EGCG与柚皮素、橙皮苷缓解大鼠便秘的作用机制

唐健，高雅倩，么春艳*，贺可可，李泓颖，肖鹏

1.无限极（中国）有限公司（广州 510623）；2.杭州医学院（杭州 310013）；3.健士星生物技术研发（上海）有限公司（上海 200335）

便秘可分为器质性便秘与功能性便秘。器质性便秘是指由于器官发生病理性变化而造成的便秘，如消化道疾病、内分泌代谢疾病等，需要专业的医学治疗。功能性便秘是指由于肠道功能产生暂时性障碍而造成的便秘，临床主要表现为排便次数少于3次/周，伴有排便间隔时间延长、排便困难等特点，主要与生活规律改变、情绪抑郁、饮食习惯、生活习惯、药物作用等相关，可通过服用功能性保健食品、改变生活习惯等方式调节改善。功能性便秘在成人尤其老年人群体中存在较高的发病率，研究显示16%的成人、36%的老年人存在便秘问题[1]。

便秘问题的形成不仅与结肠的神经调节异常相关，同时还与Cajal间质细胞（ICC）功能异常、肠道结构稳定性破坏、平滑肌收缩减缓相关[2-3]。神经系统异常包括胶质细胞退化、神经营养因子（BDNF、GDNF）、5-羟色胺（5-HT）、血清血管活性肠肽（VIP）、P物质（SP）含量紊乱。ICC在胃肠道上具备起搏功能，引导慢波传播。ICC将胃肠道神经的信号传递给平滑肌细胞，从而推动内容物运输。ICC同时也是肌肉牵张感受器[4]。

因此解决便秘问题，需要运用综合手段恢复肠道功能。

现有临床试验的便秘动物模型结果显示，长期便秘均伴随着结肠部位ICC数量降低，功能障碍等。通常选择c-Kit、SCF作为ICC的检测指标，因为c-Kit是ICC的特异性标志物，ICC的存活需要适量浓度的SCF，已知通过阻挡SCF与c-Kit结合会降低ICC数目，c-Kit会随着SCF浓度的下降而减少[5]。ICC与平滑肌之间为连接蛋白Cx43，其密度的变化可以表征神经-ICC-平滑肌整体的稳定性，平滑肌与ICC之间缝隙出现异常时，包括缝隙的增加以及消失，将会破坏信号传导通路（肠神经—ICC—平滑肌细胞）[6]。肌动蛋白相关蛋白2/3复合体（Arp2/3）是一种与肌动蛋白结合的蛋白，起到模板的作用，促进肌动蛋白的多聚化，Arp2/3复合体在微丝形成过程中发挥重要的调控作用。微丝在细胞骨架形态维持、承受外力、保持细胞内部的有序性方面起重要作用，因而Arp2/3复合体的表达对于肠道平滑肌收缩功能具备表征作用[7]。

黄茶是中国六大茶类之一。黄茶中含有的主要活性成分为茶多酚、生物碱、氨基酸和茶多糖[8]。据报道黄茶具有抗氧化、抗炎发挥抗菌、降糖、降脂等健康功效[9-10]。陈皮是药食同源食品，活性成分主要为黄酮类、生物碱类、多糖类及挥发油[11]。陈皮在临床上主要用于治疗咳嗽痰多、消化不良、小儿泄泻和厌食等疾病[12]。在前期试验研究中发现，黄茶与陈皮可以通过增加粪便质量、数量，提高小肠推进率，缓解大鼠便秘。

现有研究表明黄茶茶多酚具有通便功能，而多酚中含量最高的是EGCG，因而黄茶的通便功能可能与EGCG相关。陈皮黄酮类物质具有很强的生物活性，已有诸多相关研究报道。陈皮中的黄酮类成分以橙皮苷、柚皮素为主，推测陈皮改善便秘与这些成分相关。已有研究中鲜有关于EGCG、柚皮素、橙皮苷的通便机制报道，因此试验探索EGCG、柚皮素、橙皮苷通便作用机制，为拓宽黄茶、陈皮的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SD大鼠80只，SPF级，180±20 g，全雄，浙江省医学科学院[实验动物生产许可证号SCXK（浙）2019-0002]；黄茶冻干粉、陈皮冻干粉（黄山华绿园科技有限公司）；90% EGCG、95%橙皮苷（上海源叶生物有限公司）；97%柚皮素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；盐酸洛哌丁胺胶囊（西安杨森制药有限公司）；Ach Elisa试剂盒（南京建成生物工程研究所）；DNase/RNase-Free去离子水、FastQuant RT Kit（With gDNase）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2004电子分析天平（上海奕宇电子科技有限公司）；Cycler480实时荧光定量PCR系统（瑞士Roche）；EG1150C包埋机、RM2235切片机、TP1020脱水机（LEICA公司）；51A011 KD-P组织摊片机（浙江金华科迪仪器设备有限公司）；HGPF-50烤箱（上海跃进医疗器械有限公司）；DP260s达科为染色机（深圳市达科为医疗科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及造模

80只动物随机分为8组，即对照组（CON组）、模型组（MG组）、柚皮素低剂量组（LN组）、柚皮素高剂量组（HN组）、EGCG低剂量组（LE组）、EGCG高剂量组（HE组）、EGCG与橙皮苷组（EH组）、EGCG与柚皮素组（EN组）。模型组在第1～第7天正常喂养，第8～第11天每日夹尾2次，每次30 min。第12天灌胃7 mg/kg剂量洛哌丁胺，不夹尾。空白组第12天给予等量0.9%生理盐水（包含5%天MSO），其余期间正常饲养。LN组、HN组、LE组、HE组、EH组、EN组，样品使用0.9%生理盐水（包含5% DMSO）溶解，每天仅灌胃1次，灌胃浓度如表1所示。LN组、HN组、LE组、HE组、EH组、EN组在第1～第12天分别灌胃不同样品，第8～第11天每日夹尾2次，每次30 min。第12天灌胃7 mg/kg剂量洛哌丁胺，不夹尾。

表1 功效成分组合信息

1.3.2 观察指标

1.3.2.1 乙酰胆碱（Ach）含量测定

第12天灌胃7 mg/kg剂量洛哌丁胺，不夹尾。灌胃洛哌丁胺6 h后，大鼠禁食不禁水6 h，麻醉大鼠，腹主动脉采血，置于抗凝管中，混匀后立即在4 ℃以下以3 000 r/min离心10 min，得到血浆，在-70 ℃保存待测，按照试剂盒要求测定血浆乙酰胆碱（Ach）表达水平。

1.3.2.2 便秘大鼠结肠组织c-Kit mRNA、SCF mRNA、BDNF mRNA、GDNF mRNA、Cx43 mRNA表达水平测定

取100 mg新鲜冻存的大鼠结肠组织，置于5 mL离心管中，加入1 mL RNA hold和0.5 mL裂解液，匀浆；按照RNA提取试剂盒提取总RNA，上机检测总RNA浓度。总RNA反转录cDNA：将总RNA稀释至150 μg/L，抽取6 μL总RNA，加入4 μL Mix及10 μL无RNA酶水，共20 μL的反应体系；轻轻混匀后在42 ℃孵育10 min，在85 ℃加热5 s失活，上机检测cDNA浓度。向各管中加入12.5 μL 2×PCR Taq Mix、0.5 μL 10 μmol/L各基因的引物以及各1 μL相应的cDNA；阴性管中不加模板；各管补加水至25 μL，混匀；置于PCR仪中进行检测，PCR的统计学分析采用的是相对定量，采用RQ=2^-ΔΔCt算相对表达量。引物系列见表2。

表2 Real-time PCR引物序列

1.3.2.3 免疫组化法分析肌动蛋白（Arp2/3）的表达

结肠组织免疫组化切片经常规脱蜡脱水、磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗、高压抗原修复、PBS冲洗、3%过氧化氢溶液室温下孵育15 min、PBS冲洗50 μL，滴加一抗，置湿盒内孵育（37 ℃/1.5 h），用PBS冲洗，滴加二抗，室温下孵育30 min，滴加显色液，清水冲洗，染色封片，显微镜观察。光镜下观察，细胞质染色呈棕色者判定为阳性细胞。

1.4 数据处理与分析

所有显示的数据均采用“平均值±标准差”表示，单因素方差分析比较组间差异，用SPSS 16.0进行数据处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 乙酰胆碱（Ach）结果

如图1所示，乙酰胆碱在便秘模型组中含量极显著低于空白对照组（P＜0.01）。样品组的乙酰胆碱水平均极显著高于便秘模型组（P＜0.01）。乙酰胆碱是对肠道运动有调节作用的神经递质，通过与肠道M受体结合促使平滑肌收缩[13]，肠道内容物向前推进。结果表明，柚皮素、EGCG、橙皮苷均能通过提升Ach改善便秘。

图1 不同功效成分组合物对于乙酰胆碱的影响

2.2 c-Kit的mRNA表达结果

便秘模型组的c-Kit的mRNA表达量极显著低于空白对照组（P＜0.01）。样品组的结果均极显著高于便秘模型组（P＜0.01），低剂量柚皮素（LN组）表现最好，其次是橙皮苷与EGCG组合物（EH组）、低剂量EGCG（LE），结果说明在提高便秘模型大鼠c-Kit表达上，陈皮中的柚皮素、EGCG都是低剂量效果优于高剂量，橙皮苷与EGCG组合物优于柚皮素、EGCG组合物，如图2所示。

图2 不同功效成分组合物对于c-Kit mRNA的影响

2.3 SCF的mRNA表达结果

便秘模型组SCF的mRNA表达量极显著低于空白对照组（P＜0.01）。样品组的结果均极显著高于便秘模型组（P＜0.01），最大剂量柚皮素（HN组）提升SCF表达效果最优，其次是低剂量EGCG（LE组）、柚皮素与EGCG组合物（EN）。上述结果表明在提升SCF表达上，低剂量EGCG优于高剂量EGCG，高剂量柚皮素优于低剂量柚皮素，柚皮素与EGCG组合物优于橙皮苷与EGCG组合物，如图3所示。

图3 不同功效成分组合物对于SCF mRNA的影响

2.4 BDNF的mRNA表达结果

便秘模型组的BDNF的mRNA表达量极显著低于空白对照组（P＜0.01）。样品组的结果均极显著高于便秘模型组（P＜0.01）。橙皮苷与EGCG组合物（EH组）提升BDNF表达效果最优，其次是低剂量柚皮素（LN组）、低剂量EGCG（LE组）。上述结果表明在提升BDNF表达上，低剂量EGCG优于高剂量EGCG，低剂量柚皮素优于高剂量柚皮素，橙皮苷与EGCG组合物优于柚皮素与EGCG组合物，如图4所示。

图4 不同功效成分组合物对于BDNF mRNA的影响

2.5 GDNF的mRNA表达结果

便秘模型组的GDNF的mRNA表达量极显著低于空白对照组（P＜0.01）。样品组的结果均极显著高于便秘模型组（P＜0.01）。低剂量柚皮素（LN组）提升GDNF表达效果最优，其次是高剂量柚皮素（HN组）、低剂量EGCG（LE组）。结果表明在提升GDNF表达上，低剂量EGCG优于高剂量EGCG，低剂量柚皮素优于高剂量柚皮素，橙皮苷与EGCG组合物优于柚皮素与EGCG组合物，如图5所示。

图5 不同功效成分组合物对于GDNF mRNA的影响

2.6 Cx43的mRNA表达结果

便秘模型组的Cx43的mRNA表达量极显著低于空白对照组（P＜0.01）。样品组的结果均极显著高于便秘模型组（P＜0.01）。橙皮苷与EGCG组合物（EH组）提升Cx43表达效果最优，其次是低剂量柚皮素（LN组）、高剂量柚皮素（HN组）。上述结果表明在提升GDNF表达上，低剂量EGCG优于高剂量EGCG，低剂量柚皮素优于高剂量柚皮素，橙皮苷与EGCG组合物优于柚皮素与EGCG组合物，Cx43表达上升有利于肠道上ICC细胞信号更好地传播到平滑肌上，使得肠道状态更加稳定，肠道内容物更快速排出，减轻便秘症状，如图6所示。

图6 不同功效成分组合物对于Cx43 mRNA的影响

2.7 Arp2/3的免疫组化结果

如图7所示，光镜下观察肌动蛋白（Arp2/3）呈棕黄色，在黏膜各肌层均有Arp2/3的分布。模型组Arp2/3分布与空白对照组相比，数目减少，分布不规则。高剂量柚皮素（HN组）、低剂量EGCG（LE组）、低剂量橙皮苷与EGCG（EH组）的Arp2/3数目、分布与空白对照组相似，说明这几组功效成分组合物可以恢复受损平滑肌，增强肠道蠕动，缓解便秘问题。

图7 不同功效成分组合物对于Arp2/3的影响

3 结论

我国便秘人群众多，特别是随着老龄化加剧，老年人口便秘问题尤为突出，增加了社会负担[14]。多数通便药物具有不良反应，而植物食品来源的通便成分更安全、可靠，因此开展相关的研究显得尤为迫切[15]。

便秘的产生深层机制与Cajal细胞数量降低，相关神经递质、营养因子水平下降，平滑肌受损等有关[16-17]。已知Cajal细胞是肠道蠕动的起搏器，与平滑肌共同推动内容物蠕动，相关的神经网络会对Cajal细胞进行调节，神经网络异常也会使得蠕动减慢。多数研究表明，在便秘人群与便秘动物模型上，可以直观看到Cajal间质细胞数量降低[18]，c-Kit与SCF表达的减少[19]，肠道蠕动减慢[20]。神经调节方面，便秘群体中会出现神经兴奋递质、神经营养因子降低的现象。神经营养因子对于Cajal间质细胞产生是必不可少的，同时BDNF能够通过激活TrkB.PLC/IP3信号通路[21]，改变肠神经支配结构以及平滑肌的继发损伤，进而调节肠道动力，缓解便秘[22]。GDNF的增多能促进受损的胃肠道的修复，缓解便秘[23-24]。通过老年便秘模型大鼠观察到，连接蛋白Cx43表达下降，ICC与平滑肌之间的连接稳定性受损[25]。平滑肌的收缩功能下降也是便秘问题产生原因之一[26]。

试验中便秘大鼠口服EGCG、柚皮素后，与模型组相比结肠组织中c-Kit、SCF转录显著提高，提示Cajal细胞功能得到改善，这将有利于肠道电节律的产生，加强Cajal细胞与神经系统、平滑肌更好的相互协同作用。Cajal细胞改善伴随着胃动素受体增多，肠道推进率加快，有利于从根本上增强肠道活动能力，使得肠道蠕动增强。提升c-Kit、SCF表达上，柚皮素强于EGCG，同时橙皮苷与EGCG联用也具备改善效果，说明EGCG、柚皮素、橙皮苷可以修复肠道Cajal细胞功能，从而促进肠道转运，减轻便秘症状。Yin等[27]研究结果也显示柚皮素能够提升便秘小鼠结肠上c-Kit、SCF表达上调，与试验结果相符。GDNF来源于肠神经胶质细胞（Enteric Glial Cell，EGCs），EGCs在肠神经系统中含量最多，能调节胃肠神经活动，EGCs通过GDNF的位置发挥衔接肠道各个细胞之间的作用，从而达到维持肠道黏膜完整性的功能，因此GDNF的表达增加有利于肠神经系统损伤修复、保护肠道黏膜屏障功能，缓解便秘。脑肠轴研究中发现BDNF除了参与神经系统发育，还参与调节胃肠道动力。在BDNF基因敲除小鼠模型中，表现出肠道动力明显下降。BDNF可通过TRKB-PLC-Ca2+信号通路调节肠道动力，同时增强5-HT、Ach释放，促进平滑肌收缩[28]。GDNF、BDNFmRNA上调表明EGCG、柚皮素、橙皮苷可通过神经系统调节，改善便秘大鼠肠道功能，加快内容物传输。

试验中高、低剂量的EGCG均能提高Ach水平，表明肠道内的调控得到加强，有利于肠道运动。Zhang等[29]研究也发现EGCG能够提高大鼠Ach水平，加快肠道运输，与试验结果相符。

在EGCG、柚皮素处理之后，连接蛋白Cx43的水平显著提高，低剂量的EGCG、柚皮素优于高剂量，橙皮苷与EGCG联用效果优于单独使用EGCG，表明橙皮苷具备调节连接蛋白Cx43功能。结果表示EGCG、柚皮素、橙皮苷使得ICC与平滑肌之间的稳定性提高，Cx43作为ICC细胞与平滑肌的信息通道，该蛋白的表达增加有利于电生理信号更加顺利产生并传递至消化道平滑肌，从而使得肠道整体运动功能提升，推动物质转运。免疫组化试验结果说明，EGCG、柚皮素能够通过增加肌动蛋白（Arp2/3）的表达，平滑肌的收缩能力加强，加快肠道蠕动。试验中，与模型组相比，通过不同剂量柚皮素、EGCG之间的比较可知，低剂量柚皮素和EGCG肠道恢复及缓解便秘效果更好。

结果表明EGCG、柚皮素能够提升Cajal间质细胞标志蛋白c-Kit和SCF的转录表达，显著增加GDNF、BDNF、Ach，改善ICC与平滑肌之间受损问题，增加肌动蛋白（Arp2/3）的表达，EGCG、柚皮素通过以上机制改善大鼠便秘。EGCG与柚皮素组合、EGCG与橙皮苷组合2种组合方式也能通上述机制改善便秘。便秘问题是一个多因素相互作用形成的问题，通过调整单一的层面不能很好达到彻底解决便秘的目的。蒽醌类的植物性泻剂（如大黄、弗朗鼠李皮、番泻叶、芦荟等）、酚酞等主要通过刺激结肠黏膜中的感觉神经末梢，增强结肠动力，并刺激肠道分泌，从而促进排便，但是长期服用蒽醌类植物性泻剂会导致肠神经损害、结肠黑变病等问题[30]。试验更进一步探究EGCG与柚皮素、橙皮苷解决便秘的多条路径，可为相关通便机制研究提供参考。

综上所述，EGCG、柚皮素、橙皮苷通过调节GDNF、BDNF、Ach、c-Kit、SCF、肌动蛋白（Arp2/3）的表达，提升神经-ICC-平滑肌整体的稳定性，从而发挥通便作用。试验结果为黄茶、陈皮在健康食品中的应用提供科学依据。