稀有人参皂苷对特发性肺纤维化的影响

姚 磊，屈琳琳，范代娣*

（1西北大学化工学院，西安 710069；2西北大学生物医药研究院，西安 710069）

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种慢性进展的纤维化间质性肺炎，其特征是肺功能下降[1]，但是因其病因不明，没有较好的治疗方法，导致患者的病死率较高，平均生存期仅有2 ～ 3 年[2]。此外，在过去的几十年里，这种疾病的发病率逐年增加[3]，在治疗方法上，临床主要使用的是激素类药物、免疫抑制剂和抗氧化类药物治疗IPF[4]，但是效果并不明显，且长期使用药物的不良反应大[5]。而对于终末期的IPF 患者，最有效的方法是肺移植[6]，但由于供体不足和价格昂贵，在临床应用方面受到了很大的限制。因此，寻找安全高效缓解IPF药物迫在眉睫。

在中药中，人参（Panaxginseng）是一种性能优良的稀有药材。它具有疗效高、性质温和、不良反应小、安全性高等特点，在医疗保健等方面得到了广泛的青睐[7]。人参在传统中草药体系中有极大的应用价值[8]。多项研究证实，人参可以治疗多种疾病，如糖尿病[9]、神经性疾病[10-11]、肠道溃疡[12]、炎症[13]以及各种肿瘤[14-15]。目前已分离的人参主要活性成分有人参皂苷、多肽、多糖、黄酮类化合物等[16-17]，其中人参皂苷含量丰富，活性高，受到广泛关注。研究证实，人参总皂苷能够调控TGF-β1/Smad信号通路和MMP 途径改善博来霉素诱导的IPF 模型，其中，人参总皂苷通过下调金属蛋白酶-1、MMP-2、MMP-9、Smad2、Smad3 以及TGF-β1，上调Smad7 的表达改善IPF[18]；此外，人参皂苷Rg1 可以通过抑制TGF-β1/Smad 途径缓解烟雾诱导的气道纤维化[19]；人参皂苷Rg3 可以通过抑制HIF-1α 的核定位来缓解IPF导致的肺功能衰退[20]。

因此，本研究分别通过体内外IPF 模型，通过检测羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量及纤维化相关基因表达量探究稀有人参皂苷对IPF的影响。

1 材 料

1.1 试 剂

注射用博来霉素（bleomycin，BLM，批号：H20055883，瀚辉制药有限公司）；HYP 试剂盒（货号：BC0255，北京索莱宝科技有限公司）；转化生长因子（transforming growth factor，TGF- β1，美国Pepro Tech 公司）；Trizol、第一链反转录试剂盒（美国Thermo Fisher 公司）；氯仿、异丙醇（阿拉丁控股集团有限公司）；qPCR 试剂盒（瑞士Roche 公司）；稀有人参皂苷Rk1、Rk3、Rh4、Rg5（纯度≥98%，通过HPLC 与标准品进行对比）由西北大学生物医药研究院提供。

1.2 仪 器

TS100 倒置荧光显微镜（日本Nikon 公司）；TGL16-WS 台式高速离心机（美国贝克曼公司）；PS100 超声波清洗机（宁波恒大设备公司）；XS2 酶标仪（美国BioTek 公司）；TEC2800 石蜡包埋机（上海精密仪器仪表公司）；YD-1508A 组织切片机（北京佳源兴业科技有限公司）。

1.3 细胞与动物

人胚肺成纤维细胞MRC-5（上海富恒生物科技有限公司）； SPF 级C57BL/6 小鼠，雄性，周龄为6 ～ 8周，体重（20 ± 2）g，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。本课题中动物实验严格按照《中华人民共和国动物伦理指南》操作，获西北大学动物伦理委员会批准（批准号：NWU-AWC-20220903M）。

2 方 法

2.1 细胞培养与IPF模型建立

MRC-5 细胞在MEM 培养基中培养，二氧化碳培养箱设置为37 ℃、5% CO2和95%湿度，每2天传代1次，传代比例为1∶2。

使用转化生长因子β1（TGF-β1，10 ng/mL）处理MRC-5细胞24 h，诱导建立特发性肺纤维化模型。

2.2 MTT法检测细胞毒性

将细胞收集后使用血细胞计数板进行计数，调整细胞浓度至每毫升1 × 105个细胞，将调整好浓度的细胞悬液均匀铺在96孔板中，布板结束后，放入37 ℃培养箱培养24 h 后，将稀有人参皂苷单体粉末进行溶解、稀释，加入96 孔板中继续培养24 h。去除培养液，随后向每孔加入MTT 溶液150µL，放入培养箱孵育2 ～ 4 h，孵育结束后，去除MTT 溶液，随后向每孔加入二甲基亚砜（DMSO）溶液150 µL，使用酶标仪测量490 nm 的波长下的吸收度。

2.3 IPF小鼠模型的建立及分组处理

100 只SPF 级雄性C57BL/6 小鼠随机分组，每组10只。分别为对照组、BLM 组（35 IU/g）、低剂量Rk1（60 mg/kg）+BLM 组、高剂量Rk1（120 mg/kg）+BLM 组、低剂量Rk3（60 mg/kg）+BLM 组、高剂量Rk3（120 mg/kg）+BLM 组、低剂量Rh4（60 mg/kg）+BLM 组、高剂量Rh4（120 mg/kg）+BLM 组、低剂量Rg5（60 mg/kg）+BLM 组、高剂量Rg5（120 mg/kg）+BLM 组。除对照组外其余小鼠均腹腔注射BLM（35 IU/g）28 d 以构建IPF 模型[21]。对照组采用同等剂量生理盐水腹腔注射。造模开始第2 天治疗组通过灌胃的方式给予稀有人参皂苷，对照组和模型组分别灌胃生理盐水。连续灌胃给药28 d 后处死小鼠，取小鼠肺脏组织，经液氮快速冷冻后移至-80 ℃超低温冰箱保存备用。

2.4 小鼠肺组织病理学检查

将动物实验小鼠的肺脏组织解剖后放入多聚甲醛中进行固定，48 h 后使用不同浓度的乙醇处理，去除肺脏中的水分。将组织中的水分去除干净后，利用二甲苯溶液处理组织，使其浸透过夜。将已经泡到透明的组织浸于提前预热融化的石蜡中，进行浸蜡处理，随后放入包埋石蜡中，进行包埋处理，包埋完成后即进行切片。

对切片组织使用二甲苯溶液进行脱蜡处理，脱蜡结束后用清水冲洗，随后利用苏木精染色试剂进行染色处理，染色时长为10 min。结束染色后，再次利用清水进行冲洗，冲洗后进行脱水处理。脱水处理后，使用伊红染色液对切片进行染色，染色时长为5 min。再次脱水，透明，封片。放入通风橱进行风干，待风干完全后即可于光学显微镜下进行观察。

2.5 HYP含量测定

对于动物组织样本，称取样本0.2 g 于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，加入提取液2 mL；对于细胞样本，计数后收集细胞5 × 106个，加入提取液1 mL。随后将其放入沸水中，消化至没有可见大的团块，冷却后用NaOH（10 mol/L）调节pH 至6 ～ 8，使用蒸馏水定容至4 mL。最后放入离心机（4 ℃、12 000 r/min），离心20 min，取上清液待测。依照说明书分别稀释标准品与样品，利用酶标仪测量490 nm下的吸收度。

2.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

对于细胞样本，向处理后的MRC-5 细胞每孔加入Trizol 溶液1 mL，在冰上裂解5 ～ 10 min，随后转移至无酶EP 管；对于组织样本，取小鼠肺部组织50 mg 于研磨管中，加入研磨珠3 ～ 5 颗，向管中加入Trizol 溶液1 mL 放入研磨机中。随后放入25 ℃水浴锅中进行水浴5 ～ 10 min，向管中加入氯仿200 µL，混匀后再次25 ℃水浴10 min，水浴后放入离心机（4 ℃、12 000 r/min）离心15 min，收集上层液相350 µL 至新的EP 管中，加入异丙醇500 µL，混匀后25 ℃水浴10 min，随后放入离心机（4 ℃、12 000 r/min）离心15 min，弃去上清液，加入提前用无菌无酶水配置的75%乙醇，混匀后25 ℃水浴5 min，放入离心机（4 ℃、7 000 r/min）离心5 min，弃去上清液，风干后加无菌无酶水溶解。随后使用逆转录试剂盒将提出来的RNA 反转录为cDNA。使用cDNA 进行RT-qPCR 实验，所得到的Cq 用2-ΔΔCT法计算，选用GAPDH 作为内参，目标基因引物和内参基因引物序列如表1所述。

Table 1 RT-qPCR primer sequences

2.7 统计学分析

使用GraphPad Prism 9.0 和IBM SPSS Statistics 21.0 进行数据处理。所有实验独立重复3 次，实验结果以±s的形式表示。P＜ 0.05 即认为结果具有显著性，有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 稀有人参皂苷细胞模型浓度筛选

通过二苯基四氮唑溴盐比色法分析4 种稀有人参皂苷对MRC-5的细胞毒性，结果见图1。由图1可知，当人参皂苷Rk1、Rk3、Rh4和Rg5浓度小于0.5 µmol/L 时，MRC-5 细胞的活力大于90%，因此后续细胞实验人参皂苷使用浓度为0.5 µmol/L。

Figure 1 Effects of concentrations of rare ginsenosides (Rk1, Rk3,Rh4, Rg5) on the viability of MRC-5 cells (±s, n = 3)

3.2 对BLM 诱导的IPF 小鼠肺组织病理变化的影响

小鼠肺组织切片染色结果如图2所示，对照组小鼠的肺脏组织支气管结构无明显异常，肺泡壁由单层上皮细胞组成，结构清晰，肺泡壁没有出现增厚，肺泡腔内无明显渗出物，也没有明显的炎症细胞浸润；肺间质包括肺内结缔组织及血管等均无明显异常；与对照组相比，BLM 组小鼠肺间质较多结缔组织增生，肺泡壁出现明显增厚现象，肺泡结构不清，伴有粒细胞浸润；可见血管周围淋巴细胞灶性浸润；支气管上皮细胞变性。通过灌胃给予稀有人参皂苷后，可以发现IPF 小鼠的肺泡壁破坏有所改善，淋巴细胞浸润减少，巨噬细胞与粒细胞数量显著减少。其中Rh4的效果最为显著。

Figure 2 Lung sections of mice at day 28 after bleomycin (BLM) induction (HE staining)

3.3 对肺纤维化模型中HYP含量的影响

小鼠肺组织HYP 含量结果如图3 所示，BLM组与对照组相比，BLM 诱导的小鼠肺组织中的HYP 含量显著提高，给予人参皂苷后，HYP 含量显著降低。其中，Rh4 降低IPF 模型中的HYP 含量的效果最明显。

Figure 3 Effects of different concentrations of rare ginsenosides(Rk1, Rk3, Rh4, Rg5) on HYP content in lung tissue of IPF mice after BLM modeling (±s, n = 3)

3.4 对IPF纤维化相关基因表达的影响

使用TGF-β1 诱导MRC-5 构建细胞IPF 模型。MRC-5 细胞中IPF 相关基因表达量如图4。由图4可知，TGF-β1 组与对照组相比，TGF-β1 诱导的MRC-5细胞中COL1A1、纤维连接蛋白与α-SMA 的mRNA 表达量明显增加；Rk1, Rk3, Rh4, Rg5 组与TGF-β1 组相比，4 种人参皂苷均可以降低MRC-5细胞中COL1A1、纤维连接蛋白与α-SMA 的mRNA表达量；其中Rh4组的效果最为显著。

Figure 4 Effect of rare ginsenosides (Rk1, Rk3, Rh4, Rg5) on the expression level of fibrosis-related genes in IPF of MRC-5 after TGF-β 1 modeling (±s, n = 3)

使用腹腔注射BLM 构建小鼠IPF 模型,小鼠肺组织中IPF 相关基因表达量如图5。由图5 可知，BLM组与对照组相比，BLM诱导的IPF小鼠肺部组织中COL1A1、纤维连接蛋白与α-SMA 的mRNA 表达量增加；Rk1, Rk3, Rh4, Rg5 组与BLM 组相比，加入人参皂苷后显著降低了COL1A1、纤维连接蛋白与α-SMA 的mRNA 表达量。其中Rh4 组的效果最为显著。

Figure 5 Effect of rare ginsenosides (Rk1, Rk3, Rh4, Rg5) on IPFrelated mRNA expression in lung tissue of mice after BLM modeling(±s, n = 3)

3.5 对IPF炎症相关基因表达的影响

使用TGF-β1 诱导MRC-5 构建细胞IPF 模型。MRC-5 细胞中IPF 的炎症相关基因表达量如图6。由图6可知，TGF-β1组与对照组相比，TGF-β1诱导的MRC-5 细胞中IL-6 和TNF-α 的mRNA 表达量明显增加；Rk1, Rk3, Rh4, Rg5 组与TGF-β1 组相比，4 种人参皂苷均可以降低MRC-5 细胞中IL-6 和TNF-α 的mRNA 表达量；其中Rh4 组的效果最为显著。

Figure 6 Effect of rare ginsenosides (Rk1, Rk3, Rh4, Rg5) on expression levels of inflammatory genes in IPF in MRC-5 modeled by TGF-β1（±s, n = 3)

使用腹腔注射BLM 构建小鼠IPF 模型,小鼠肺组织中IPF 的炎症相关基因表达量如图7。由图7可知，BLM 组与对照组相比，BLM 诱导的IPF 小鼠肺部组织中IL-6 和TNF-α 的mRNA 表达量增加；Rk1, Rk3, Rh4, Rg5 组与BLM 组相比，加入人参皂苷后显著降低了IL-6和TNF-α的mRNA表达量。

Figure 7 Effect of rare ginsenosides (Rk1, Rk3, Rh4, Rg5) on expression levels of inflammatory genes in IPF in MRC-5 modeled by BLM(±s, n = 3)

3.6 对IPF凝血级联相关基因表达的影响

使用TGF-β1 诱导MRC-5 构建细胞IPF 模型。MRC-5 细胞中IPF 的凝血级联相关基因表达量如图8。由图8 可知，TGF-β1 组与对照组相比，TGFβ1 诱导的MRC-5 细胞中Factor X 和plasminogen 的mRNA 表达量明显增加；Rk1, Rk3, Rh4, Rg5 组与TGF-β1 组相比，4 种人参皂苷均可以降低MRC-5细胞中Factor X 和plasminogen的mRNA表达量；其中Rh4组的效果最为显著。

Figure 8 Effect of rare ginsenosides (Rk1, Rk3, Rh4, Rg5) on coagulation cascade mRNA expression in lung tissue of mice after TGF-β1 modeling (±s, n = 3)

使用腹腔注射BLM 构建小鼠IPF 模型,小鼠肺组织中IPF的凝血级联相关基因表达量如图9。由图9 可知，BLM 组与对照组相比，BLM 诱导的IPF小鼠肺部组织中Factor X 和plasminogen 的mRNA表达量增加；Rk1, Rk3, Rh4, Rg5 组与BLM 组相比，加入人参皂苷后显著降低了Factor X 和plasminogen的mRNA表达量。

Figure 9 Effect of rare ginsenosides (Rk1, Rk3, Rh4, Rg5) on coagulation cascade mRNA expression in lung tissue of mice after BLM modeling (±s, n = 3)

4 讨论与结论

本研究的IPF 模型采用腹腔注射BLM（35 IU/g）28 d[21]，建模完成后，通过HE 染色可知，BLM 诱导的IPF 小鼠肺部组织的肺泡壁增厚，伴有粒细胞浸润，以及淋巴细胞灶性浸润等，这与IPF 的病理进程基本一致，表明IPF 模型建立成功，然而加入稀有人参皂苷后，IPF 引起的肺泡结构破坏等病理进程得到了缓解。

HYP 作为胶原纤维的标志性水解产物，HYP的含量可以直接反应胶原的沉积情况，胶原蛋白的过度沉积是纤维化疾病的主要特征。因为HYP是胶原所特有的氨基酸，约占胶原氨基酸总量的13%，利用生物化学法（如比色法和高效液相色谱法）测定组织中HYP 的总含量已经成为纤维化严重程度评价最常用的方法，该方法在2017 年被美国胸科协会确立为肺纤维化临床前评价的重要标准[22]。本研究通过测定发现，TGF-β1 组的MRC-5细胞与BLM组的小鼠肺部组织中HYP含量显著增加，加入稀有人参皂苷后，HYP含量显著降低。

研究发现，凝血级联（coagulation cascade）指的是在受损的血管处产生纤维蛋白进而防止失血过度[23]。在伤口愈合的初期，内皮与上皮损伤均可以激活凝血级联反应，从而产生凝血酶，紧接着凝血酶使血清中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白[24]。研究证明，凝血级联与IPF 患者肺部组织中的纤维蛋白沉积关系密切，在IPF 患者肺部组织中发现外源性凝血级联和纤溶酶的几种酶原（Factor X、plasminogen）被激活[25]。研究表明，IPF 患者的肺泡灌洗液中促凝血因子增加，导致ECM 沉降减少[26]；同时蛋白酶激活受体诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，从而加剧了IPF。本研究发现TGF-β1 诱导的MRC-5细胞与BLM 诱导的小鼠肺部组织中纤维化相关蛋白基因（如：COL1A1、α-SMA 和纤维连接蛋白）、炎症相关基因（如：IL-6和TNF-α）和凝血级联相关基因（如：Factor X 和plasminogen）的表达量均有明显增加，加入稀有人参皂苷后，纤维连接蛋白、COL1A1、α-SMA、IL-6、TNF-α、Factor X 和plasminogen的基因表达量均有明显下降。

综上所述，稀有人参皂苷（Rk1、Rk3、Rh4、Rg5）均可以通过降低HYP 含量，下调纤维连接蛋白、COL1A1、α-SMA、IL-6、TNF-α、Factor X 和plasminogen 的基因表达缓解IPF。其中，稀有人参皂苷Rh4 的效果最为显著。本研究为稀有人参皂苷缓解IPF 进程提供了理论依据，并为今后的临床应用提供了需要改进的方向和数据支持。