骨髓间充质干细胞源性外泌体促进小胶质细胞/巨噬细胞M2极化抑制急性期脑缺血大鼠炎症反应

孙逸梅，毛诗慧，李 琳，江伟锋，储利胜

（浙江中医药大学基础医学院，杭州 310053）

脑卒中是中枢神经系统最常见的疾病，严重威胁人类健康。脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中占所有卒中病例的70% ～ 80%[1]。脑缺血发病机制非常复杂，其中继发性炎症反应在脑缺血损伤中发挥重要作用[2-3]。目前，组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator, tPA）是临床治疗脑缺血的唯一有效药物，但由于治疗时间窗窄和出血转化的风险，其临床应用受到限制[4]。神经炎症是缺血性脑卒中的发病机制之一，主要涉及外周炎症细胞的浸润、小胶质细胞活化和炎症介质的过度产生。探索炎症的机制，寻求有效治疗靶点，对脑缺血防治具有重要意义。

小胶质细胞是脑内固有的免疫细胞。在生理条件下，小胶质细胞处于静息状态，监测脑内微环境维持中枢神经稳态[5-6]。脑缺血后小胶质细胞被激活，活化的小胶质细胞主要有M1 和M2 两种表型。其中M1 型小胶质细胞高表达CD16/32，释放肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin 6, IL-6）等加剧神经损伤；而M2 型小胶质细胞高表达精氨酸酶-1（arginase-1, Arg-1）、CD206,释放抗炎因子白细胞介素-10（interleukin-10, IL-10）、转化生长因子-β（transforming growth factor β, TGF-β）等，促进炎症消退和神经修复，发挥神经保护作用。因此，促进激活的小胶质细胞从M1 型向M2 型转化为脑缺血的治疗提供了一个新策略[7]。

近年来临床和动物实验研究发现，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）移植治疗脑缺血安全有效，具有很好的临床应用前景[8]。早期研究认为干细胞治疗是通过分化替代死亡的神经细胞。然而，最近的研究表明，间充质干细胞旁分泌的外泌体可以到达缺血部位，改善脑缺血损伤并促进神经功能恢复[9-10]。外泌体（exosomes, Exos）是细胞分泌的重要细胞囊泡，其内含有核酸、蛋白质和脂类等生物活性物质，介导细胞间通讯，在生理和病理过程中发挥重要作用[11]。大量研究发现，骨髓间充质干细胞源性外泌体（BMSC-Exos）对脑缺血有很好的治疗作用，其作用机制包括调节细胞增殖、迁移、分化、凋亡、炎症和代谢等生理和病理过程[12]。实验室前期研究发现，BMSC-Exos促进脑缺血后小鼠血管生成减轻脑缺血损伤，然而是否能够调节小胶质细胞/巨噬细胞M2 极化尚未清楚[13]。本研究旨在观察BMSC-Exos 对脑缺血后3 d 小胶质细胞/巨噬细胞M1/M2极化和神经炎症的影响。

1 材 料

1.1 试 剂

胎牛血清购于（美国Gemini公司）；DMEM/F12培养基（浙江吉诺生物医药技术有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒、CD9 抗体（美国Bioworld 公司）；ALIX，TSG101（美国Abcam 公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2, 3, 5-triphenyltetrazole chloride, TTC）染料（上海源叶生物科技有限公司）；兔抗Iba1（日本Wako公司）；鼠抗CD16/32（美国BD 公司）；山羊抗CD206（美国RD 公司）；FITC 标记的羊抗兔二抗、Cy3 标记的羊抗鼠二抗、FITC 标记的驴抗羊二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Cy3标记的驴抗兔二抗（美国Jackson ImmunoResearch 公司）；Triton X-100、DIPA、羊血清（上海碧云天生物技术有限公司）；RNAiso 总RNA 提取试剂、SYBR Green®定量PCR 预混试剂、PrimeScript反转录预混液、无核酸酶水（大连宝生物工程有限公司）。

1.2 仪 器

HM525NX 冰冻切片机（中国赛默飞世尔科技有限公司）；H-7650 型透射电子显微镜（日本日立公司）；DMIL 型荧光显微镜（德国Leica 公司）；NS300 型 纳米颗粒跟踪分析仪（英国Malvern 公司）；T100TMRNA 反转录仪、CFX96 实时荧光定量PCR 仪、ChemiDocTMImaging System 型凝胶图像处理系统（美国Bio-Rad公司）。

1.3 动 物

SPF级SD大鼠，3 ～ 4月龄，体重（280 ± 10）g，4周龄体质量（80 ± 10）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006，饲养于浙江中医药大学实验动物中心[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2018-0012]。动物饲养环境温度为（22 ± 1） ℃，相对湿度为40%～ 60%，12 h/12 h 明暗交替。本研究严格按照动物实验伦理规范进行实验（伦理审查批准号：IACUC-20181126-13）。

2 方 法

2.1 BMSCs的分离和培养

参照实验室前期报道的方法[14-15]。简言之，收集细胞悬液后离心10 min，用DMEM/F12培养基重悬后放入CO2培养箱中。培养至第3 ～ 5 代的细胞用于后续实验。

2.2 BMSC-Exos的分离提取

收集骨髓间充质干细胞上清液，在4 ℃条件下，94 r/min 离心10 min，624 r/min 离心10 min，3 120 r/min 离心30 min，弃沉淀，用0.22 µm 微孔滤膜过滤后，4 ℃，31 200 r/min 超高速离心2 h，使用预冷的PBS重悬，放置于-80 °C冰箱保存备用。

2.3 BMSC-Exos的鉴定

透射电镜（transmission electron microscope,TEM）观察BMSC-Exos 形态：取20 µL BMSCs-Exos悬液滴加到载样网上，滴加1%醋酸双氧铀溶液在室温下负染1 min，干燥后放入样品室内，观察并拍摄照片。免疫印迹法检测CD9、CD63、TSG101、ALIX、GAPDH 的蛋白表达：悬液经凝胶电泳后转膜、封闭后，加入一抗CD9、CD63、TSG101、ALIX、GAPDH（1∶1 000）孵育过夜。加入二抗（1∶2 000）孵育2 h，洗涤后化学发光显色并置于凝胶图像处理系统下拍摄并使用Image J 软件进行灰度分析。纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）测定BMSC-Exos 粒径大小：BMSC-Exos 悬液置于样本池内，NTA分析仪测定BMSC-Exos粒径。

2.4 大鼠大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型制备

参照改良的Longa 等[15]建立MCAO 模型。大鼠麻醉后分别将颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉分离，将颈外动脉结扎并剪断，剪一个小口，将4-0单丝尼龙线从颈外动脉缺口处插入并推至颈内动脉中18 ～ 20 mm，缺血90 min后将尼龙线拔出。假手术组的尼龙线仅插入5 mm。

2.5 实验分组

大鼠随机分为假手术组（Sham 组）、模型组（MCAO 组）、骨髓间充质干细胞源性外泌体组（BMSC-Exos 组）每组15 只。BMSC-Exos 组大鼠在缺血90 min 后立即经尾静脉注射BMSC-Exos（100 µg，500 µL），假手术组和模型组大鼠注射等容积PBS。

2.6 神经功能评分

缺血后第1、2、3 天，分别参照Longa 评分[11]和角实验[12]检测大鼠神经功能缺损。Longa 评分标准：0——无缺损；1——悬尾时对侧前肢屈曲；2——向损伤侧转圈；3——向损伤对侧倾倒；4——意识不清，无法正常行走。角实验是将两块（30 cm × 20 cm × 1 cm）木板以30°夹角相互连接，在交接处留出间隙并将大鼠放在夹角正中央。观察大鼠左右转的次数，重复10次并记录。

2.7 梗死体积检测

大鼠麻醉后断头取脑，将大鼠大脑冷冻，切成6 个冠状切片，浸泡在2% TTC 染液中孵育20 min，用4%多聚甲醛固定后拍照。使用Image J 软件计算梗死面积，并按如下公式校正：梗死体积百分比（%）=[左半脑体积 - （右半脑体积 - 梗死体积）]/左半脑体积 × 100。

2.8 免疫荧光双标检测M1/M2 型小胶质细胞/巨噬细胞

缺血后第3 天，各组大鼠经左心室插管注入0.9%氯化钠溶液（400 mL）快速冲洗，用4%多聚甲醛溶液灌流和固定。取脑后将大脑置于4%多聚甲醛固定，然后分别经20%和30%的蔗糖溶液脱水。对所需脑区进行冰冻切片制备10 µm脑片。使用0.3% Triton X-100 破膜25 min；5%山羊血清/驴血清室温封闭1 h，分别加入兔抗Iba1/鼠抗CD16/32（1∶100），兔抗Iba1/山羊抗CD206（1∶100），孵育48 h 后加入相对应的荧光二抗（1∶100），室温避光孵育1 h，封片，在荧光显微镜下拍照，Image J 软件计数双标阳性细胞数。

2.9 RT-qPCR 检测M1/M2 型小胶质细胞/巨噬细胞相关标志物mRNA表达

Trizol 法提取大鼠脑缺血周边区组织的总RNA，按照PrimeScriptTMRT Master Mix 试剂盒说明书进行反转录。按照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒进行PCR。反应体系：2 × SYBR Premix Ex TaqⅡ 5.0 µL、上下游引物各0.4 µL、cDNA 1.2 µL、双蒸水3.0 µL。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，循环40次。内参为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH），采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列见表1。

Table 1 Primer sequences for real-time

2.10 统计学分析

在SPSS 25.0 软件中进行数据分析，实验结果以±s表示。先进行正态分布及方差齐性检验，Longa 评分和角实验数据采用非参数检验中的Kruskal-Wallis 检验进行分析，满足正态分布以及方差齐性样本采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间两两比较采用Student-Newman-Keuls检验。P＜ 0.05认为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 BMSC-Exos的鉴定

在TEM 下观察BMSC-Exos 的形态，结果发现BMSC-Exos 茶托样或凹半球样，具有双层膜结构，符合外泌体的特征性结构。NTA结果显示，BMSCExos 的平均粒径大小为107.4 nm。使用Western blot 对BMSC-Exos 标志性蛋白表达进行检测，结果表明，与BMSCs比较，BMSC-Exos几乎不表达GAPDH，而高表达外泌体标记蛋白CD9、CD63、TSG101和ALIX。超离所得上清液中不含有GAPDH、CD9、CD63、TSG101、ALIX，这些结果表明所提取的BMSC-Exos纯度较高，可用于后续实验（图1）。

Figure 1 Identification of BMSC-Exos

3.2 BMSC-Exos对急性期脑缺血大鼠神经功能的影响

脑缺血后第1、2、3天，模型组大鼠均呈现严重的神经功能缺损，说明脑缺血大鼠模型成功建立；脑缺血后第2、3 天，与模型组比较，BMSC-Exos 组大鼠神经功能评分显著降低（P＜ 0.01 或P＜0.05），右转次数显著减少（P＜ 0.01 或P＜ 0.05）,见图2。

Figure 2 Neurological deficits of the rats in each group (±s, n = 15)

3.3 BMSC-Exos对急性期脑缺血大鼠梗死体积的影响

与假手术组相比，模型组脑缺血大鼠脑梗死体积显著增加（P＜ 0.01）；与模型组相比较，BMSC-Exos 组脑缺血大鼠脑梗死体积显著减小（P＜ 0.05），见图3。

Figure 3 Comparison of cerebral infarct volume in each group (xˉ±s, n = 6)

3.4 BMSC-Exos 对急性期脑缺血大鼠小胶质细胞/巨噬细胞M1极化的影响

与假手术组相比，模型组CD16/32+/Iba1+阳性细胞数量显著增加（P＜ 0.01）；与模型组比较，BMSC-Exos 组CD16/32+/Iba1+阳性细胞数量显著减少（P＜ 0.01）（图4）。

Figure 4 Effect of BMSC-Exos on M1 polarization of microglia/macrophage in rats with cerebral ischemia (±s, n = 6)

3.5 BMSC-Exos 对急性期脑缺血大鼠小胶质细胞/巨噬细胞M2极化的影响

与假手术组相比，模型组小胶质细胞/巨噬细胞分支缩短，胞体增大；与模型组比较，BMSC-Exos组CD206+/Iba1+阳性细胞数量显著增加（P＜0.01），见图5。

Figure 5 Effect of BMSC-Exos on M2 polarization of microglia/macrophage in rats with cerebral ischemia (±s, n = 6)

3.6 BMSC-Exos 对急性期脑缺血大鼠M1 型小胶质细胞/巨噬细胞标志物mRNA的影响

与假手术组相比，模型组M1型小胶质细胞/巨噬细胞标志物 iNOS、CD86、TNF-α 的mRNA 表达显著增加（P＜ 0.01）；与模型组相比，BMSC-Exos组M1型小胶质细胞/巨噬细胞标志物iNOS、CD86、TNF-α 的mRNA 表达显著减少（P＜ 0.01 或P＜0.05），见图6。

Figure 6 Effect of BMSC-Exos on the mRNA expression of M1 microglia/macrophage markers after cerebral ischemia in rats (±s, n = 3)

3.7 BMSC-Exos 对急性期脑缺血大鼠M2 型小胶质细胞/巨噬细胞标志物mRNA的影响

与模型组相比，BMSC-Exos 组M2 型小胶质细胞/巨噬细胞标志物Arg-1、TGF-β、IL-10 的mRNA表达显著增加（P＜ 0.05），见图7。

4 讨 论

BMSCs 衍生的外泌体由于其免疫调节和再生特性，是治疗急性中枢神经系统损伤的有前途的治疗剂，其作用机制包括调节细胞凋亡[16]、血管生成[17]以及神经发生[18]等。然而，BMSC-Exos 是否能够调节脑缺血后第3 天小胶质细胞/巨噬细胞从M1 向M2 极化来抑制急性神经炎症鲜有文献报道。本研究发现BMSC-Exos促进小胶质细胞/巨噬细胞从M1 表型转化为M2 表型来抑制脑缺血后神经炎症,改善急性脑缺血损伤。

在生理状态下，小胶质细胞通过监测病原体和与损伤相关的分子模式，吞噬凋亡神经元维持体内平衡。小胶质细胞根据微环境信号不同调整其表型，包括经典激活的M1 型和替代激活的M2型[19]。M1 型小胶质细胞膜上高表达CD16/32，释放大量促炎因子如TNF-α、iNOS 等对神经元产生毒性加剧脑损伤。M2 型小胶质细胞膜上高表达CD206，分泌抗炎因子，如TGF-β、Arg-1 等，同时释放IGF-1 和脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor, BDNF）等神经营养因子，促进炎症消退和神经修复。因此，本研究选取了CD16/32、CD86、iNOS、TNF-α、CD206、Arg-1、IL-10 和TGF-β等作为M1型/M2型小胶质细胞/巨噬细胞标志物。

在脑缺血急性期，缺血核心区和梗死周围区均可检测到激活的小胶质细胞[20-21]。Hu 等[22]在小鼠局灶性脑缺血模型中发现，在缺血后3 d M1 型小胶质细胞/巨噬细胞数量逐渐增加，持续增加到缺血后14 d；而M2型小胶质细胞/巨噬细胞在缺血后1 ～ 3 d 开始增加，3 ～ 5 d 达到高峰。因此，本实验选择脑缺血后第3 天检测BMSC-Exos 对小胶质细胞/巨噬细胞M1/M2极化的影响。

BMSCs被证实可调控脑内小胶质细胞/巨噬细胞激活以及炎症反应。Bai 等[23]发现将BMSCs 移植到MCAO 大鼠脑组织中能够显著增加CD206 阳性细胞数，降低TNF-α 阳性细胞数。实验室前期研究发现，BMSCs 移植能够调节MCAO 大鼠模型中小胶质细胞从M1 型转化为M2 型，减轻神经炎症，促进神经功能恢复[24]。早期研究认为干细胞治疗是通过分化替代死亡的神经细胞，发挥神经修复作用。然而，最近的研究表明，干细胞主要通过旁分泌作用发挥作用。

外泌体是BMSCs 旁分泌的活性成分之一。BMSC-Exos 被证实能够调节小胶质细胞/巨噬细胞表型从而在急性中枢神经损伤中发挥抗炎作用[25]。Wang等[26]证实骨髓间充质干细胞条件培养基通过抑制M1 小胶质细胞/巨噬细胞缓解脊髓损伤。Wen 等[27]提出BMSC-Exos 调节小胶质细胞表型来抑制创伤性脑损伤后的神经炎症。实验室前期研究发现，BMSC-Exos促进脑缺血小鼠血管生成发挥神经保护作用[13]。这些结果提示BMSC-Exos 可能对小胶质细胞/巨噬细胞M2 极化同样存在调节作用。本研究通过免疫荧光双标实验发现，大鼠脑缺血后第3 天，与假手术组相比，模型组小胶质细胞/巨噬细胞分支缩短，胞体变大，出现典型的阿米巴样巨噬细胞形态特征。BMSC-Exos 治疗后小胶质细胞/巨噬细胞M1 型标志物CD16/32 减少，M2型标志物CD206 增多。RT-qPCR 结果进一步发现，BMSC-Exos 减少iNOS、CD86、TNF-α 释放，促进Arg-1、TGF-β、IL-10 释放。上述结果提示，BMSCExos 促进大鼠脑缺血后第3 天小胶质细胞/巨噬细胞从M1 型向M2 型转化，抑制脑缺血后急性炎症反应。

综上所述，本研究结果提示BMSC-Exos 促进脑缺血后小胶质细胞/巨噬细胞M2型极化，从而抑制脑缺血再灌注损伤引起的急性炎症反应，然而BMSC-Exos 对急性期脑缺血后小胶质细胞/巨噬细胞极化的分子机制的调控尚待进一步研究。