蛋白棕榈酰化修饰在非酒精性脂肪性肝病相关疾病中作用机制的研究进展

张雅琳，颜 利，居峰禹，王文辉*，于 烨**

（1中国药科大学基础医学与临床药学学院，南京 210009；2中国药科大学药学院，南京 210009）

NAFLD 是与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤，包括单纯性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver, NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis, NASH）。NAFL 病理特征为肝脏仅存在脂肪变性且无肝细胞损伤（如肝细胞气球样变），NASH 除脂肪变性外还有肝细胞损伤、炎症和不同程度肝纤维化。全球约25%的人口罹患该病[1]，尤其发达国家发病率居高不下，发展中国家如我国，NAFLD 发病率也迅速上升[2]。随着病情发展，约25% NAFLD 患者所患类型为NASH，大大增加晚期纤维化、肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）及肝病相关死亡的风险[3]。NAFLD 已成为全球范围内威胁人类健康的重大公共卫生问题，但其复杂的疾病进展机制致使新药研发困难重重，至今只有印度批准saroglitazar 用于治疗非肝硬化NASH。因此，探寻NAFLD发病新机制、药物新靶点，对研发治疗NAFLD的有效药物至关重要。

NAFLD 是一个多致病因素共同参与的肝脏病变，包括环境、遗传和饮食等方面。环境因素，如二手烟引起AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）去磷酸化失活以增加固醇调节元件结合蛋白1（sterol-regulatory element binding protein-1, SREBP-1）的活化，导致甘油三酯（triglyceride, TG）在肝细胞中异常堆积[4]；空气中的颗粒污染物（如PM2.5）直接改变肝细胞的DNA、蛋白质和脂质等生物大分子的结构和功能，诱导细胞内发生氧化应激[5]。遗传因素体现为父母患NAFLD 会增加子女患病风险[6]，尤其携带p. I148M 突变的Patatin 样磷脂酶结构域3（Patatin-like phospholipase domain-containin, PNPLA3）人群患病风险更高[7]。还有如跨膜6 超家族成员2（transmembrane 6 superfamily member 2, TM6SF2）等关键基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）正是中国人群对NAFLD 遗传易感更高的原因[6]。饮食方面，随着生活水平的提高，高脂和高能量食物占据人们的餐桌，加之久坐不动的生活方式，导致能量摄入与消耗的极大失衡[8]。

在这些致病因素作用下，肝脏出现脂质代谢紊乱，主要体现在外源脂肪摄取过多和内源脂肪生成增加大大超过载脂蛋白对其向肝外转运和机体对脂肪分解利用的能力。此时，脂肪合成相关通路磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase, AKT/PKB）-哺乳动物雷帕霉素靶标（mammalian target of rapamycin, mTOR）被异常激活[9]；机体出现胰岛素抵抗（insulin resistance, IR），促进脂肪分解[10]，加剧肝脏中游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）的积累[11]。过量FFA 及其代谢产物产生脂毒性，诱发肝脏炎症推动病程进展至NASH。其中，核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）是炎症激活的关键调节因子，可促进白介素-1β（interleukin-1beta, IL-1β）、白介素-8（interleukin-8, IL-8）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）等下游炎症因子表达，且该通路的激活程度与肝脏损伤和组织学变化程度密切相关[12]。长期慢性炎症反应上调Hedgehog 信号通路水平，激活肝窦周Disse腔内肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSC）产生细胞外基质[13-14]，促进NASH纤维化，最终发展为晚期的肝硬化[15]。

针对以上NAFLD 脂质异常沉积、炎症反应和纤维化不同阶段潜在靶点的在研药物种类繁多，如趋化因子受体2/5（chemokine receptor 2/5, CCR2/5）抑制剂、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma, PPARγ）激动剂和法尼醇X 受体（farnesoid X receptor, FXR）合成配体等，且部分药物进入临床试验，但目前尚无一款药物被FDA 批准上市[16]。系统理解致病因素引发NAFLD病变过程并揭示其中的关键机制是研发有效药物的重要突破口。

1 棕榈酰化修饰与NAFLD

长期高脂饮食打破机体脂质代谢稳态，导致FFA（尤其是棕榈酸）水平升高[17]，关于这一生化特征对NAFLD病程进展作用的认识尚不清晰。棕榈酸（palmitic acid, PA）及其衍生物可作为棕榈酰化修饰的重要底物。因此，NAFLD 患者体内高水平棕榈酸及蛋白棕榈酰化修饰或将是联系致病因素与NAFLD病理变化的关键纽带。

1.1 棕榈酰化修饰

棕榈酰化是发生在所有真核细胞内的一种翻译后修饰，由棕榈酰基转移酶催化连接含有16 个碳原子的PA 到靶蛋白上。根据修饰位点残基可将棕榈酰化大致分为3 类：S-棕榈酰化、N-棕榈酰化和O-棕榈酰化。大多数棕榈酰化修饰发生在蛋白质的半胱氨酸（cysteine, Cys）残基上，通过硫酯键连接，即为S-棕榈酰化，具有可逆性。当棕榈酰基添加到N 末端的Cys 残基时，形成硫酯中间体并重排为稳定的酰胺键，即为N-棕榈酰化[18]。O-棕榈酰化发生在丝氨酸残基上，由酯键连接[19]。后两种类型都不可逆。

棕榈酰化修饰由酰基转移酶家族（protein acyltransferases, PATs）催化，根据修饰位点可将PATs 可分为3 类：DHHC 家族（S-棕榈酰化）、同属多跨膜O-酰基转移酶（membrane-bound O-acyltransferase, MOBAT）家族的porcupine(PORCN)（O-棕榈酰化）和hedgehog (Hh)酰基转移酶（Hh acyltransferase, HHAT）（N-棕榈酰化）。DHHCs 具有4 ～ 6 个跨膜结构域（transmembrane domain,TMD），保守的天冬氨酸-组氨酸-组氨酸-半胱氨酸（aspartate-histidine-histidine-cysteine, DHHC）序列是该家族的共同特征[20]。该序列折叠为锌指结构域并与锌离子配位稳定蛋白质结构[21]。已确定的24 个具有DHHC 结构域的蛋白质都具有棕榈酰基转移酶催化活性[22]。不同于DHHC 家族，MOBATs具有8 ～ 12 个TMD，共享两个关键氨基酸残基，即高度保守的天冬氨酸/天冬酰胺和稳定的组氨酸[23]。大多DHHCs、PORCN 和HHAT 都定位在内质网（endoplasmic reticulum, ER）和高尔基体上[23-24]。DHHCs 及PORCN 首先自身发生棕榈酰化，随后将脂肪酸链转移至目的蛋白上完成修饰[25-26]。

1.2 棕榈酰化修饰的生物学作用

棕榈酰化修饰在调节蛋白质稳定性、膜运输和亚细胞定位等方面具有重要作用（图1）。棕榈酰基能减少所修饰蛋白质被运输到含有E3泛素连接酶的膜结构域或降低E3泛素连接酶对赖氨酸残基的可及性来防止蛋白质泛素化，进而抑制蛋白酶体降解途径，增加蛋白质的稳定性[27]。如多种肿瘤细胞上高度表达的程序性死亡配体-1（programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1）在Cys272 残基位点上发生S-棕榈酰化后抑制其泛素化，阻止溶酶体降解，增加与T 细胞上的程序性死亡受体1（programmed death-1, PD-1）的结合水平，显著抑制T 细胞毒性作用，驱动肿瘤细胞从免疫监视中逃逸[28]。另一方面，棕榈酰基的疏水性增强所修饰蛋白的脂溶性，使其更易与生物膜结合。S-棕榈酰化的可逆性调节是协调蛋白质分选以及介导蛋白质在细胞器间运送的重要机制[27]。如Ras 蛋白家族，新合成Ras蛋白转运到高尔基体，须进行棕榈酰化修饰才能进入分泌途径转移到质膜，到达质膜被激活后即发生去棕榈酰化反应[29]，膜结合力变弱而被运送回高尔基体[30]。Ras 动态棕榈酰化精细调控其在质膜与高尔基体间的循环防止其在质膜上非特异性驻留，且有利于活化的Ras转运到高尔基体或ER向下游传递信号[31]。

图1 蛋白棕榈酰化修饰分类和功能

异常棕榈酰化修饰与多种疾病密切相关。目前相关研究多集中于神经系统疾病（如阿尔茨海默病和亨廷顿病）和免疫系统疾病领域（如克罗恩病）。与阿尔茨海默病相关的β-淀粉样蛋白（amyloid β -protein, Aβ）是淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）被β-淀粉样蛋白前体蛋白切割酶1（beta-site APP cleaving enzyme 1, BACE1）切割生成[32]。这一反应中，BACE1（Cys474、Cys478、Cys482 和Cys485）[33]和APP（Cys186 和Cys187）发生棕榈酰化，使其富集于脂筏中[34]，且APP 在脂筏中对BACE1 亲和力更高[35]。亨廷顿病源于亨廷顿蛋白突变体的N 末端谷氨酰胺残基过度扩展，阻碍棕榈酰基转移酶DHH17 对Cys214 进行棕榈酰化修饰，导致蛋白聚集形成不溶于水的包涵体，致使神经元死亡[36]。克罗恩病的重要易感基因核苷酸寡聚化结构域（nucleotide binding oligomerization domain, NOD）样受体2（NOD2）是细胞内模式识别蛋白，免疫平衡条件下促使潘氏细胞产生抗菌蛋白（如α-防御素）以及杯状细胞分泌黏液来维持肠道上皮屏障完整性[37]。当肠道细菌进入上皮细胞，NOD2 识别微生物相关的胞壁酰二肽（muramyl dipeptide, MDP）并被募集至细菌相关内体的膜上激活NF-κB 通路产生炎症因子（如IL-1β）参与防御肠道细菌入侵，同时阻止Toll样受体2（toll like receptor 2, TLR2）在识别肽聚糖后过度激活NF-κB 通路[38]。NOD2 精确膜靶向的关键在于其多个Cys 残基位点被DHHC5 棕榈酰化修饰[39]。患者中常见的NOD2 功能丧失突变（3020insC，R702W，L248R，A612T，A755V 和R1019stop）导致S-棕榈酰化水平降低约70%至90%，抑制NOD2 的内体膜靶向。同时，NOD2 突变体无法抑制TLR2/NF-κB信号通路过度激活及其下游产物IL-12、1L-1β 和干扰素γ（interferon gamma,IFN-γ）对肠道上皮细胞的进一步损伤，诱发肠道细胞免疫失调，极大增加克罗恩病患病风险[39]。

近期研究发现参与脂质代谢和糖代谢的重要蛋白功能执行也受到棕榈酰化修饰调控[27]。因此，相关蛋白异常棕榈酰化在代谢疾病包括NAFLD中也发挥重要作用。

1.3 蛋白异常棕榈酰化修饰在NAFLD中的作用

1.3.1 CD36 CD36 是一种跨膜糖蛋白，表达于血小板、脂肪细胞和肝细胞等多种细胞，在脂质积累、炎症信号传导和氧化应激等过程中发挥重要作用[40]。CD36 的N 端和C 端Cys 残基位点（Cys3、Cys7、Cys464 和Cys466）发生S-棕榈酰化，蛋白亲脂性上升使其靶向质膜分布[41]。与正常和NAFL肝脏相比，CD36 在NASH 患者和小鼠模型的肝细胞质膜定位显著增加[42]。小分子抑制CD36棕榈酰化降低其对质膜的亲和力，阻碍其向质膜易位，缓解小鼠NASH[42]。CD36 棕榈酰化缺失还可以增强其向线粒体分布[43]，并与长链酰基辅酶A 合成酶1（long-chain acyl-coenzyme A synthetases 1, ACSL1）相互作用，作为将长链脂肪酸转运到ACSL1 的分子桥增加长链酰基辅酶A 在线粒体的分布，从而促进脂肪酸（fatty acid, FA）氧化[43]。肝细胞内催化CD36 棕榈酰化的关键酶包括DHHC6 和DHHC7[44-45]。在NASH 肝脏中表达增加的Krüppel 样转录因子10（Krüppel-like factor 10, KLF10）上调DHHC7 转录水平促进CD36 棕榈酰化[44]。硒蛋白K（selenoprotein K, SelK）是一种ER 蛋白，在NASH小鼠肝脏中表达上调，一方面通过Src 同源3（srchomology 3, SH3）结构域与DHHC6 相互作用提高其催化效率，另一方面加速棕榈酰化CD36 整合到细胞质外壳蛋白复合物Ⅱ(cytoplasmic coat protein complex II, COPII)囊泡中，促进CD36 从ER 向高尔基体转运[45]，加速疾病进程[46]。另外，在脂肪细胞内发现DHHC4 在高尔基体上修饰CD36 使其靶向质膜，而DHHC5 在质膜上维持CD36 的棕榈酰化状态[47]。

1.3.2 AKT NAFLD 进展中PI3K-AKT 信号通路异常激活，上调脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FASN）、SREBPs 和乙酰辅酶A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase, ACC）等多个与脂质合成相关基因的表达，促进肝内脂质从头生成（de novo lipogenesis,DNL）[48]。AKT 是该通路的关键信号传导分子，研究表明AKT 促进NAFLD 肝脏内脂质过度合成和脂肪变性且抑制脂肪酸氧化；肝脏过表达AKT 可诱导小鼠发生NASH[49]；肝脏特异性敲除AKT 可改善肝内脂肪沉积并下调PI3K-AKT 通路下游的脂质合成基因[50]。AKT 功能执行有赖于其Cys344 残基S-棕榈酰化修饰，促进其定位到质膜并被磷脂酰肌醇依赖性激酶1（3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1, PDK1）磷酸化激活[51]。广谱棕榈酰基转移酶抑制剂2-溴十六烷酸（2-bromopalmitate, 2-BP）阻止AKT 靶向质膜转运[52]，且未棕榈酰化的AKT 转而更多定位于溶酶体[51]。而且，FASN介导的内源性合成PA 能进一步诱导AKT 棕榈酰化，形成DNL异常活跃下的正反馈[52]。

1.3.3 MyD88 TLR4-髓系分化初级反应蛋白（myeloid differentiation primary response 88,MyD88）-NF-κB 通路在NAFLD 中被过多饱和脂肪酸（saturated fatty acid, SFA）激活，增加下游炎症细胞因子（如TNF-α，IL-6 和IL-1β）表达并引起免疫性肝损伤[53]。MyD88 活化需要DHHC6 介导的Cys113 和Cys274 位点棕榈酰化修饰[54]。FASN 介导从头合成的内源性FA 与CD36 介导肝细胞摄取的外源性FA 协同促进MyD88 棕榈酰化[54]。FASN还调控膜胆固醇水平利于外源性脂肪酸的流入，维持细胞内PA 池[54]。在NASH 小鼠模型中，FASN信号通路被抑制后能减弱MyD88 依赖性的TLR 信号传导及下游炎症反应[49,54]。

1.3.4 Hedgehog Hh 是一类与胚胎发育有关的信号蛋白，在ER中被HHAT催化，于N-末端Cys发生N-棕榈酰化，通过酰胺键连接棕榈酰基增加蛋白疏水性，随后被包装入分泌囊泡、转运到质膜处释放[55]。正常肝细胞不产生Hh 蛋白，而NASH 中损伤的肝细胞重新表达Hh 蛋白，并活化肝星状细胞产生胶原纤维，启动纤维修复[56]。持续激活的Hh 通路推动NASH 肝脏纤维化进展，且与HCC 发生、迁移和侵袭密切相关[57]。Hh通路抑制剂可有效阻止肝星状细胞活化增殖，具有抗纤维化作用[58]。

1.4 棕榈酰化修饰与NAFLD相关HCC

NAFLD 和NASH 患者进展为HCC 的发生率分别为0.44‰和5.29‰，且近年来呈指数级增长，逐渐成为当今HCC 的主流病因[59]。NAFLD 进展至HCC 的潜在分子机制未完全清楚，目前认为是肝脏长期炎症环境引起肝细胞癌变。鉴于棕榈酰化修饰在调控炎症反应方面的重要作用，异常棕榈酰化修饰可能参与推动NAFLD 相关HCC 发生发展。

癌症干细胞（cancer stem cell, CSC）学说认为CSC 形成是包括HCC 在内多种肿瘤症发生的始发因素。体外研究发现PA 处理可显著提高HepG2细胞形成CSC球体的能力[60]，剂量依赖性上调多能干基因（如Sox2，Oct4 和Shh）表达水平，激活NFκB 通路[61]。HepG2 球体中多个蛋白质（如α-烯醇化酶、c-Myc启动子结合蛋白1和黏着斑蛋白等）发生棕榈酰化修饰，棕榈酰化抑制剂图尼霉素和2-BP 抑制PA 诱导HepG2 CSC 球体形成[60]。以上提示体内持续高水平PA 诱导的异常蛋白棕榈酰化可能触发NAFLD 相关HCC 肝脏CSC 起始形成，这一猜想有待在动物模型进一步探索。

1.5 NAFLD相关棕榈酰基转移酶

异常棕榈酰化修饰离不开相应酶的催化作用，已报道调控NAFLD 进展中CD36、MyD88 和Hh异常棕榈酰化的酶包括DHHC6、DHHC7和HHAT，进而促进脂肪酸摄取、激活炎症通路并可启动纤维化修复，推动NAFLD不同阶段进展（表1）。

表1 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)相关棕榈酰基转移酶与其所修饰底物及作用

棕榈酰基转移酶家族庞大，目前已知NAFLD相关棕榈酰基转移酶家族可能是冰山一角。为了探索棕榈酰基转移酶家族在NAFLD进展中的表达规律和作用机制，本文对GEO 数据库中NAFLD 患者肝活检样品的所有棕榈酰基转移酶转录本进行分析（图2），发现与健康人群肝组织相比，NAFL 患者肝内PORCN 与DHHC2、3、7、8、11、12、14、18、22、24 和NASH 患者肝内DHHC2、3、13、24 表达呈升高趋势；HHAT 表达在NAFL 和NASH 人群中均明显增加。

图2 NAFLD患者肝组织棕榈酰基转移酶转录水平变化（±s）

2 总结与展望

NAFLD 发病机制复杂，目前在研的多是单一靶向药物（如CCR2/5 抑制剂、PPARγ 激动剂和FXR 激动剂等），部分药物已进入临床试验，但尚无一款被FDA 批准上市。临床试验阶段暴露出一系列安全性和有效性问题，如FXR 激动剂奥贝胆酸使血清LDL 水平升高可增加动脉粥样硬化等其他相关疾病风险；PPARγ 激动剂吡格列酮会导致体重增加和体液潴留；CCR2/5 抑制剂cenicriviroc无法有效改善肝细胞脂肪变性和气球样变。即使印度批准上市的PPARα/γ双重激动剂saroglitazar，仅限适用于治疗非肝硬化NASH，提示NAFLD 不同病程阶段用药靶点和治疗策略存在差异。且新进入临床试验的药物也多在已有药物的结构基础上进行优化。寻找新的突破口是现阶段的一大挑战。NAFLD 进展中参与调控脂质代谢紊乱、炎症反应和纤维修复关键分子的棕榈酰化水平异常增加，是推动病程进展的重要生化反应事件。广谱棕榈酰基转移酶抑制剂2-BP 的非特异靶向、脱靶不良反应和相关毒性问题限制其走向临床应用[62]。因此，NAFLD 进展中催化不同病程阶段蛋白异常棕榈酰化的关键酶可成为治疗NAFLD 的新靶点。研发高效靶向关键棕榈酰基转移酶的小分子药物或利用PROTAC 技术直接降解这些酶可将成为精准治疗NAFLD及相关HCC的新策略。