sTIM-3及其配体Gal-9、HMGB1与2型糖尿病并发冠心病的相关性研究

刘艳秋　范海迪　侯海燕　孙健　林宁

摘要：目的 探討血清中可溶性T细胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3（sTIM-3）、半乳糖凝集素-9（Gal-9）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）水平与2型糖尿病（T2DM）并发冠心病（CHD）的关系。方法 选取T2DM组患者50例、T2DM并发CHD组（T2DM+CHD组）患者52例，同期健康体检人员（Con组）48例。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测3组血清中sTIM-3、Gal-9及HMGB1的水平。Spearman法分析血清sTIM-3、Gal-9、HMGB1、空腹血糖（FBG）、超敏C-反应蛋白（hs-CRP）间的相关性；使用受试者工作特征（ROC）曲线分析sTIM-3、Gal-9及两者联合检测对T2DM并发CHD的诊断能力；采用Logistic回归分析T2DM并发CHD的危险因素。结果 与Con组相比，T2DM组和T2DM+CHD组sTIM-3、Gal-9、HMGB1升高（P＜0.05）；与T2DM组相比，T2DM+CHD组sTIM-3和Gal-9升高（P＜0.05），HMGB1差异无统计学意义。FBG、hs-CRP与sTIM-3、Gal-9、HMGB1呈正相关，sTIM-3与Gal-9、HMGB1，Gal-9与HMGB1呈正相关（P＜0.05）。ROC曲线分析结果显示血清sTIM-3和Gal-9联合诊断T2DM并发CHD曲线下面积为0.812（95%CI：0.743～0.882）。Logistic回归分析显示体质量指数、sTIM-3、Gal-9升高是T2DM并发CHD的危险因素。结论 血清sTIM-3、Gal-9升高是T2DM并发CHD的危险因素。

关键词：糖尿病，2型；冠状动脉疾病；半乳糖凝集素类；高迁移率族蛋白质类；可溶性T细胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3

中图分类号：R392.6文献标志码：ADOI：10.11958/20221307

Correlation research between sTIM-3 and its ligands Gal-9， HMGB1 in patients with type 2 diabetes complicated with coronary heart disease

LIU Yanqiu FAN Haidi HOU Haiyan SUN Jian LIN Ning

1 Department of Clinical Laboratory， Branch Hospital of Huai'an First People's Hospital， Huai'an 223002， China;

2 Department of Clinical Laboratory， Qinhuai District Center for Disease Control and Prevention; 3 Department of

Clinical Laboratory， Huai'an First Hospital Affiliated to Nanjing Medical University

△Corresponding Author E-mail： hayyln@126.com

Abstract： Objective To investigate the relationship between serum soluble T cell immunoglobulin and mucin domain-3 （sTIM-3）， galectin-9 （Gal-9） and high mobility group protein B1 （HMGB1） levels in patients with type 2 diabetes mellitus （T2DM） complicated with coronary heart disease （CHD）. Methods Fifty patients with T2DM were used as the T2DM group， and fifty-two patients with T2DM complicated with CHD were selected as the T2DM+CHD group. Forty-eight healthy physical examination subjects were selected as the control group （Con group）. Serum levels of sTIM-3， Gal-9 and HMGB1 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Spearman correlation analysis was used to analyze the correlation between serum sTIM-3， Gal-9， HMGB1， fasting blood glucose （FBG） and high-sensitivity C-reactive protein （hs-CRP）. Receiver operating characteristic curve （ROC） was used to analyse the diagnostic capability of sTIM-3， Gal-9 and their combination in T2DM complicated with CHD. Logistic regression was used to investigate the risk factors of T2DM complicated with CHD. Results Compared with the Con group， sTIM-3， Gal-9 and HMGB1 were significantly increased in the T2DM group and the T2DM+CHD group （P＜0.05）. Compared with the T2DM group， sTIM-3 and Gal-9 were significantly increased in the T2DM+CHD group （P＜0.05）， and there was no significant difference in HMGB1. FBG and hs-CRP were positively correlated with sTIM-3， Gal-9 and HMGB1， sTIM-3 was positively correlated with Gal-9 and HMGB1， and Gal-9 was positively correlated with HMGB1 （P＜0.05）. ROC curve analysis showed that the area under the curve of serum sTIM-3 and Gal-9 in the diagnosis of T2DM complicated with CHD was 0.812 （95%CI： 0.743-0.882）. Logistic regression analysis showed that increased body mass index， sTIM-3 and Gal-9 were risk factors for T2DM complicated with CHD. Conclusion Increased serum levels of sTIM-3 and Gal-9 are risk factors for T2DM complicated with CHD.

Key words： diabetes mellitus， type 2; coronary disease; galectins; high mobility group proteins; sTIM-3

据国际糖尿病联合会统计，目前全世界约有5.37亿人患糖尿病，其中90%左右为2型糖尿病（T2DM）［1］。冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease，CHD）简称为冠心病，是糖尿病的大血管并发症之一，动脉粥样硬化是CHD的病理基础，与非糖尿病患者比较，糖尿病患者发生动脉粥样硬化斑块的风险更大，程度也更重［2］。T细胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3，TIM-3）是一种膜蛋白，表达在活化的辅助性T细胞（Th）1、自然杀伤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞等细胞表面［3］。TIM-3还存在可溶性蛋白的形式，即可溶性TIM-3（soluble TIM-3，sTIM-3）。sTIM-3来源于TIM-3基因表达水平升高与TIM-3从细胞膜表面脱落增加两种情况［4］。TIM-3与其配体半乳糖凝集素-9（galectin-9，Gal-9）相互作用，抑制T细胞功能［5］。高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein 1，HMGB1）是TIM-3的另一个重要配体［6］。研究发现，TIM-3表达与一些慢性疾病如糖尿病、动脉粥样硬化、慢性病毒感染、类风湿性关节炎等相关性较强［7］。但sTIM-3及其配体Gal-9、HMGB1在T2DM并发CHD中的作用尚不明确。本研究通过检测T2DM并发CHD患者血清中sTIM-3、Gal-9、HMGB1的变化，旨在发现T2DM并发CHD疾病的新型检测标志物。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2019年2月—2021年12月于淮安市第一人民医院分院确诊并住院治疗的单纯T2DM患者（T2DM组）、T2DM并发CHD患者（T2DM+CHD组）和同期健康体检者（Con组）。T2DM的诊断符合2018年美国糖尿病协会糖尿病诊疗标准；CHD诊断符合中华医学会心血管病分会制定的《慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南》。排除标准：（1）患CHD外的T2DM其他并发症者。（2）患急性心肌炎、严重心力衰竭者。（3）患自身免疫性疾病、血液系统疾病及其他重要脏器功能不全者。最终纳入T2DM组50例，男26例，女24例，年龄31～76岁，平均（52.74±8.90）岁；T2DM+CHD组52例，男25例，女27例，年龄28～72岁，平均（53.15±8.62）岁；Con组48例，男23例，女25例，年龄34～77岁，平均（51.62±9.31）岁。本研究经患者知情同意，通过淮安市第一人民医院分院伦理委员会批准（伦理批号：HAYYFY2019-KY002）。

1.2 资料收集 一般资料：收集年龄、性别、体质量指数（BMI）。实验室资料：采集所有研究对象空腹静脉血，使用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（上海双赢生物科技有限公司）检测血清sTIM-3、Gal-9、HMGB1含量；使用日立全自动生化分析仪7600检测空腹血糖（FBG）、超敏C-反应蛋白（hs-CRP）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）与高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）；使用伯乐糖化血红蛋白分析仪D-10检测糖化血红蛋白（HbA1c）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，若方差不齐，组间多重比较采用Tamhane's T2检验；若方差齐，则采用LSD-t检验。非正态分布的计量资料用M（P₂₅，P₇₅）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间多重比较采用Bonferroni法。计数资料采用例（%）表示，组间比较用χ²检验。相关性分析采用Spearman法。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析指标对T2DM并发CHD的诊断能力。使用多因素Logistic回归分析T2DM并发CHD的影响因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组间临床资料比较 3组间性别、年龄、TC差异无统计学意义。与Con组相比，T2DM组BMI、FBG、HbA1c、hs-CRP升高，HDL-C降低（P＜0.05）；T2DM+CHD组BMI、FBG、HbA1c、hs-CRP、TG、LDL-C升高，HDL-C降低（P＜0.05）。与T2DM组相比，T2DM+CHD组BMI、hs-CRP、TG、LDL-C升高，HDL-C降低（P＜0.05）。见表1。

2.2 3组间sTIM-3、Gal-9和HMGB1比较 与Con组相比，T2DM组和T2DM+CHD组sTIM-3、Gal-9和HMGB1升高（P＜0.05）；与T2DM相比，T2DM+CHD组sTIM-3和Gal-9升高（P＜0.05），HMGB1差异无统计学意义。见表2。

2.3 sTIM-3、Gal-9、HMGB1和FBG、hs-CRP的相关性分析 在所有受试者中，FBG与sTIM-3、Gal-9、HMGB1呈正相关，rs分别为0.613、0.472、0.619（P＜0.05）。hs-CRP與sTIM-3、Gal-9、HMGB1呈正相关，rs分别为0.596、0.466、0.476（P＜0.05）。sTIM-3与Gal-9、HMGB1呈正相关，rs分别为0.527和0.690（P＜0.05）；Gal-9与HMGB1呈正相关（rs=0.466，P＜0.05）。

2.4 sTIM-3、Gal-9及两者联合检测对T2DM并发CHD的诊断能力 ROC曲线结果显示，sTIM-3、Gal-9及两者联合检测诊断T2DM并发CHD的ROC曲线下面积（AUC）分别是0.794、0.735、0.812，联合诊断效能更高，但sTIM-3诊断特异度较高，见表3、图1。

2.5 T2DM并发CHD发生的影响因素 以T2DM是否合并CHD为因变量（否=0，是=1），以BMI、年龄、sTIM-3、Gal-9、HMGB1为自变量，进行Logistic回归分析。结果显示BMI、sTIM-3、Gal-9升高是T2DM并发CHD的危险因素（P＜0.05），见表4。

3 讨论

T2DM以高血糖、胰岛素抵抗和慢性T细胞活化为特征，伴有低度慢性炎症［8］。研究证实，人体血糖稳态紊乱后会激活T细胞，CD4+T细胞与CHD、颈动脉粥样硬化等疾病发展有关［9］。Wang等［10］研究发现，T2DM患者NK细胞表面TIM-3表达水平显著增加，且与HbA1c和FBG水平呈正相关。还有学者发现，与健康对照组相比，T2DM患者血清中sTIM-3水平显著升高［11］。本研究结果显示，与Con组相比，T2DM组患者血清中sTIM-3显著升高，且血清sTIM-3的水平和hs-CRP呈正相关，表明sTIM-3可能参与了T2DM导致的低度慢性炎症的发展。Zhang等［12］研究发现，TIM-3在CHD患者外周血CD4+T细胞表面高表达，且随着CHD病情的加重而升高。Hou等［13］研究发现，冠状动脉粥样硬化患者外周血NK细胞表面TIM-3表达增加，且TIM-3与CRP和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平相关。本研究中，与Con组、T2DM组相比，T2DM+CHD组患者血清中sTIM-3水平显著升高，且sTIM-3与FBG呈正相关。推测人体血糖代谢紊乱导致外周血细胞膜表面sTIM-3脱落增加，影响了动脉粥样硬化相关的炎症微环境，进一步导致T2DM并发CHD的进展。

Gal-9是半乳糖结合蛋白家族的一员，最初作为T淋巴细胞分泌的一种嗜酸性粒细胞趋化因子而被发现，其在免疫调节中发挥重要作用［14］。Gal-9是TIM-3的配体，参与细胞聚集、黏附、分化［15］、凋亡［16］和炎症反应［17］等。Sun等［18］发现，肥胖合并糖尿病患者血浆Gal-9水平显著高于健康对照组和单纯肥胖组，且肥胖合并糖尿病组的Gal-9水平与空腹胰岛素和C肽呈正相关。本研究发现，与Con组相比，T2DM组患者血清中Gal-9水平显著升高，推测原因为高糖状态下，Gal-9通过与Th1细胞上表达的TIM-3结合，调节Th1免疫反应，从而调节T2DM的疾病进展。Kurose等［19］发现，T2DM合并慢性肾病的患者肾小球滤过率越低，血清Gal-9水平越高。本研究中，与T2DM组相比，T2DM+CHD组患者血清中Gal-9水平显著升高，且Gal-9与sTIM-3、FBG、hs-CRP呈正相关。推测可能为T2DM患者机体内升高的Gal-9水平加剧了机体的慢性炎症和应激反应，参与了动脉粥样硬化的发生和进展。

HMGB1是一种高度保守的核蛋白，由坏死细胞被动释放，由炎性细胞和一些非免疫细胞主动分泌［20］。Behl等［21］发现，HMGB1通过促进晚期糖化终产物受体和toll样受体结合，进而激活核因子（NF）-κB通路，刺激与糖尿病相关的炎性因子产生，加重糖尿病相关的免疫和代谢反应。Chen等［22］发现，T2DM患者血清中HMGB1上调，且HMGB1水平与血清白细胞介素（IL）-6和TNF-α相关。本研究中T2DM患者血清HMGB1水平明显高于Con组，且HMGB1与sTIM-3、FBG、hs-CRP呈正相關，推测可能是机体的高糖环境导致HMGB1水平持续升高，激活NF-κB信号通路，诱导炎性因子的产生和分泌，加重T2DM引起的慢性炎症状态。Benlier等［23］发现，与健康受试者相比，冠状动脉疾病患者的血清HMGB1水平显著增加。但在本研究中，T2DM组和T2DM+CHD组患者血清HMGB1水平差异无统计学意义，且HMGB1不是T2DM并发CHD发生的影响因素，推测高血糖可诱导HMGB1水平升高，但T2DM并发CHD疾病状态下血清HMGB1水平并没有持续升高。

本研究ROC曲线显示，sTIM-3和Gal-9联合诊断的效能较高，表明sTIM-3与Gal-9联合检测能够提高对T2DM并发CHD的诊断能力，但是血清sTIM-3的诊断特异度更佳。Logistic回归分析结果显示，高水平的BMI、sTIM-3、Gal-9增加了T2DM并发CHD的发病风险。

综上所述，sTIM-3、Gal-9可能通过影响炎症的发生发展参与T2DM并发CHD的发病机制，有望成为T2DM并发CHD的新型检验标志物。由于本研究样本量有限，未对T2DM合并CHD患者进行亚组分析，存在一定局限，且血清中sTIM-3与其配体Gal-9相互作用的具体机制尚不完全明确，还需深入研究。

参考文献

［1］ GUO J，SMITH S M. Newer drug treatments for type 2 diabetes［J］. BMJ，2021，373：n1171. doi：10.1136/bmj.n1171.

［2］ THOMAS M C. Type 2 diabetes and heart failure：Challenges and solutions［J］. Curr Cardiol Rev，2016，12（3）： 249-255. doi：10.2174/1573403x12666160606120254.

［3］ DIXON K O，DAS M，KUCHROO V K. Human disease mutations highlight the inhibitory function of TIM-3［J］. Nat Genet，2018，50（12）：1640-1641. doi：10.1038/s41588-018-0289-3.

［4］ GROSSMAN T B，MINIS E，LOEB-ZEITLIN S E，et al. Soluble T cell immunoglobulin mucin domain 3（sTim-3）in maternal sera：A potential contributor to immune regulation during pregnancy［J］. J Matern Fetal Neonatal Med，2021，34（24）：4119-4122. doi：10.1080/14767058.2019.1706471.

［5］ HASTINGS W D，ANDERSON D E，KASSAM N，et al. TIM-3 is expressed on activated human CD4+ T cells and regulates Th1 and Th17 cytokines［J］. Eur J Immunol，2009，39：2492-2501. doi：10.1002/eji.200939274.

［6］ CHEN S，DONG Z，YANG P，et al. Hepatitis B virus X protein stimulates high mobility group box 1 secretion and enhances hepatocellular carcinoma metastasis［J］. Cancer Lett，2017，394：22-32. doi：10.1016/j.canlet.2017.02.011.

［7］ 鐘玉梅，陈洋，罗小超，等. Tim-3调控巨噬细胞极化在类风湿性关节炎中的研究进展［J］. 天津医药，2020，48（9）：898-902. ZHONG Y M，CHEN Y，LUO X C，et al. Research progress of Tim-3 regulating the polarization of macrophage in rheumatoid arthritis［J］. Tianjin Med J，2020，48（9）：898-902. doi：10.11958/20200625.

［8］ KAMATA Y，TAKANO K，KISHIHARA E，et al. Distinct clinical characteristics and therapeutic modalities for diabetic ketoacidosis in type 1 and type 2 diabetes mellitus［J］. J Diabetes Complications，2017，31（2）：468-472. doi：10.1016/j.jdiacomp.2016. 06.023.

［9］ NYAMBUYA T M，DLUDLA P V，MXINWA V，et al. T-cell activation and cardiovascular risk in adults with type 2 diabetes mellitus：A systematic review and meta-analysis［J］. Clin Immunol，2020，210：108313. doi：10.1016/j.clim.2019.108313.

［10］ WANG H，CAO K，LIU S，et al. Tim-3 expression causes NK cell dysfunction in type 2 diabetes patients［J］. Front Immunol，2022，13：852436. doi：10.3389/fimmu.2022.852436.

［11］ 石新慧. 可溶性Tim-3在疾病中的表达及其意义的研究［D］. 北京：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，2016. SHI X H. Expression and clinical significance of soluble Tim-3 in different diseases［D］. Beijing：Institute of Basic Medical Sciences，Academy of Military Medical Sciences，2016.

［12］ ZHANG J，ZHAN F，LIU H L. Expression level and significance of Tim-3 in CD4+ T lymphocytes in peripheral blood of patients with coronary heart disease［J］. Braz J Cardiovasc Surg，2022，37（3）：350-355. doi：10.21470/1678-9741-2020-0509.

［13］ HOU N，ZHAO D，LIU Y，et al. Increased expression of T cell immunoglobulin- and mucin domain-containing molecule-3 on natural killer cells in atherogenesis［J］. Atherosclerosis，2012，222（1）：67-73. doi：10.1016/j.atherosclerosis.2012.02.009.

［14］ HAO H，HE M，LI J，et al. Upregulation of the Tim-3/Gal-9 pathway and correlation with the development of preeclampsia［J］. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2015，194：85-91. doi：10.1016/j.ejogrb.2015.08.022.

［15］ HIRASHIMA M，KASHIO Y，NISHI N，et al. Galectin-9 in physiological and pathological conditions［J］. Glycoconj J，2002，19（7/8/9）：593-600. doi：10.1023/B：GLYC.0000014090.63206.2f.

［16］ SAKAI K，KAWATA E，ASHIHARA E，et al. Galectin-9 ameliorates acute GVH disease through the induction of T-cell apoptosis［J］. Eur J Immunol，2011，41（1）：67-75. doi：10.1002/eji.200939931.

［17］ MANSOUR A A，RAUCCI F，SAVIANO A，et al. Galectin-9 regulates monosodium urate crystal-induced gouty inflammation through the modulation of Treg/Th17 ratio［J］. Front Immunol，2021，12：762016. doi：10.3389/ fimmu.2021.762016.

［18］ SUN L，ZOU S，DING S，et al. Circulating T cells exhibit different TIM3/Galectin-9 expression in patients with obesity and obesity-related diabetes［J］. J Diabetes Res，2020，2020：2583257. doi：10.1155/2020/2583257.

［19］ KUROSE Y，WADA J，KANZAKI M O，et al. Serum galectin-9 levels are elevated in the patients with type 2 diabetes and chronic kidney disease［J］. BMC Nephrol，2013，14：23. doi：10.1186/1471-2369-14-23.

［20］ SU Z，WANG T，ZHU H，et al. HMGB1 modulates Lewis cell autophagy and promotes cell survival via RAGE-HMGB1-Erk1/2 positive feedback during nutrient depletion［J］. Immunobiology，2015，220（5）：539-544. doi：10.1016/j.imbio.2014.12.009.

［21］ BEHL T，SHARMA E，SEHGAL A，et al. Expatiating the molecular approaches of HMGB1 in diabetes mellitus：Highlighting signalling pathways via RAGE and TLRs［J］. Mol Biol Rep，2021，48（2）：1869-1881. doi：10.1007 /s11033-020-06130-x.

［22］ CHEN Y，QIAO F，ZHAO Y，et al. HMGB1 is activated in type 2 diabetes mellitus patients and in mesangial cells in response to high glucose［J］. Int J Clin Exp Pathol，2015，8（6）：6683-6691.

［23］ BENLIER N，ERDO?AN M B，KE?IO?LU S，et al. Association of high mobility group box 1 protein with coronary artery disease［J］. Asian Cardiovasc Thorac Ann，2019，27（4）：251-255. doi：10.1177/0218492319835725.

（2022-08-22收稿 2022-10-12修回）

（本文編辑 李志芸）