大承气汤用于过敏性哮喘对MAPK 信号通路和Th1/Th2 型细胞因子影响的动物模型研究

尹志鹏，张 全，谭 俊，雷明盛

（湖南省张家界市人民医院 呼吸与危重症医学科，湖南 张家界 427000）

哮喘是一种患病人数较多的呼吸系统疾病，其典型特征是患者气道存在慢性炎症及高反应性[1]。西医对其的治疗主要是给予糖皮质激素进行抗炎、β2 受体激动剂舒张支气管等[2]。大承气汤最早记载于《伤寒论》中，为“肺肠同治”典型药方，有通腑泄热、峻下热结等效，以往常用于治疗胰腺炎、肠梗阻等病症[3]。有研究报道，大承气汤能够改善呼吸窘迫综合征等肺系疾病患者肺部损伤，并减轻其炎症反应，改善患者免疫功能[4-5]。目前关于大承气汤用于过敏性哮喘的研究较少，其治疗过敏性哮喘的作用机制也缺乏理论依据支持。有研究报道，辅助性T 细胞（Th）1/Th2 比例失衡在哮喘发作中有重要地位；同时，有研究显示，p38 蛋白激酶（p38 MAPK）通过调控白细胞介素（IL）-4 等细胞因子参与到炎症反应中，由此推测大承气汤治疗过敏性哮喘、减轻炎症反应可能与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）与Th1/Th2 平衡有关[6-7]。本次研究对过敏性哮喘小鼠应用大承气汤，观察大承气汤对MAPK 信号通路和Th1/Th2 的影响，以探讨大承气汤治疗过敏性哮喘的机制，为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 BALB/c 小鼠40 只，6 ～8 周龄，体质量20 ～25 g，恒温恒湿，自由食水。

1.1.2 药物、试剂与仪器 美国Sigma 公司生产，卵清白蛋白（OVA），四甲基乙二胺（TEMED），十二烷基硫酸钠（SDS）十二烷基硫酸，批号依次是SLBM7240V，T9281，L3771；地塞米松片（福州海王福药制药有限公司，国药准字H35021170）；美国Thermo 公司生产，BCA 蛋白测定试剂盒，广谱彩虹预染低蛋白Marker，氢氧化铝凝胶，批号依次是A53225，26628，R1235952B；美国CST 公司生产，磷酸化（p）-MAPK 单克隆抗体，MAPK 单克隆抗体，批号依次是9910，9926；美国Abgent 公司生产，羊抗小鼠免疫球蛋白（Ig）G-辣根过氧化物酶（HRP）二抗，β-肌动蛋白（β-actin）抗体，批号分别为ASS1007，AM1021B；Bio legend 公司生产，IL-4 ELISA Kit、IL-17A ELISA Kit、INF-γ ELISA Kit，批号分别为B187236、B181929、B1887025；深圳达科生物技术公司生产，mIL-5 检测试剂盒；迪夫快速染液，批号为L9210789。显微镜（美国Olympus 公司，型号TH4-200），石蜡切片机（德国Microm 公司，型号HM325），1703930 型湿转电转印仪、数码凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司），高速离心机（德国Eppendorf公司，型号5415），酶标仪（瑞士Tecan公司）。1.1.3 大承气汤的制备 大承气汤药方组成：大黄、枳实各12 g，厚朴24 g，芒硝9 g，药物浸泡30 min 后，武火煎煮10 min，再以文火煎煮20 min，煎煮2 次，将所得药液混合，水煎浓缩含生药1.9 g/mL，通过双层纱布滤过药液，分装储存于4℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的构建与给药 小鼠适应性饲养7 d后，通过随机数字表法将小鼠分为空白对照组（A组）、模型组（B 组）、地塞米松组（C 组）和大承气汤组（D 组），每组各10 只。通过OVA 致敏激发构建过敏性哮喘小鼠模型，分别在第0 天、第14 天，B 组、C 组和D 组每只小鼠于腹腔注射0.2 mL 抗原液（氢氧化铝2 mg，OVA 20 μg），A 组给予等量生理盐水注射；第21 ～27 天，将小鼠放进雾化箱中，B 组、C 组和D 组雾化吸入1% OVA 激发，A 组小鼠给予生理盐水雾化，每日1 次，每次0.5 h；C 组及D 组在雾化前1 h 分别给予地塞米松及大承气汤干预，每只0.2 mL，A 组、B 组给予等量生理盐水。地塞米松给药量：0.005 g/kg，大承气汤给药量：19 g/mL。

1.2.2 肺指数测定 实验结束后，测量小鼠体质量。小鼠麻醉后处死，打开胸腔，取出肺组织，通过生理盐水冲净后吸除其表面液体，测量肺组织质量，肺指数＝小鼠肺质量（g）/小鼠体质量（g）×100 %。

1.2.3 气管肺泡灌洗液（BALF）的获取及细胞计数 气管插管插入气管内1 cm 进行缝合固定，用0.8 mL 含0.5 %牛血清白蛋白（BSA）的无菌PBS 缓冲液灌洗气管、支气管及全肺并回收，进行离心处理后使用1 mL 含0.5 % BSA 的PBS 缓冲液重悬细胞计算细胞总数，通过迪夫染液迅速染色，拍照，细胞分类计数，取300 个细胞计算其中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的比例，依据细胞总数计算BALF 中各类炎症细胞数量。

1.2.4 蛋白免疫印迹法检测MAPK 信号通路蛋白表达 造模完毕后，取100 mg 肺组织，放在冰上的1.5 mL离心管中，然后放进-80℃冰箱中储存。使用RIPA 裂解液提取总蛋白后对蛋白浓度进行检测，利用聚丙烯酰胺电泳依据相对分子质量大小进行分离，利用湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），加入封闭液后置于摇床上于室温下封闭孵育2 h，将一抗p38 蛋白激酶（p38 MAPK），细胞外调节蛋白激酶（ERK），p-p38 MAPK 及p-ERK1/2 按1:1 000 稀释后分别加入适量，摇床上4℃孵育过夜；使用聚山梨酯与三乙醇胺缓冲盐水溶液（TBST）缓慢冲洗3 次，分别加入相应1:5 000 稀释后二抗，于室温下孵育2 h，TBST 缓慢冲洗3 次，通过化学发光试剂，暗室内曝光显影，进行图像分析，检测目的蛋白及内参β-actin 灰度值。

1.2.5 BALF 中细胞因子检测 取离心后染色清液，通过对应试剂盒对人干扰素-γ（INF-γ）、IL-4、IL-5、IL-17A 水平进行检测。

1.2 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验，多组间行方差齐性检验；计数资料以例（%）表示，采用χ2检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组小鼠肺指数水平比较 A组肺指数为（0.639±0.003），B 组肺指数为（0.725±0.005），C 组肺指数为（0.680±0.006），D 组肺指数为（0.673±0.005），肺指数水平：A 组＜D 组＜C 组＜B 组（P＜0.05）。

2.2 4 组小鼠BALF 中细胞总数及各类炎症细胞数目比较 总细胞数水平：A 组＜C 组＜D 组＜B 组（P＜0.05）；嗜酸性粒细胞水平：A 组＜C 组＜D 组＜B 组（P＜0.05）；中性粒细胞水平：A组＜C组＜D组＜B组（P＜0.05）；淋巴细胞水平：A 组＜C 组＜D 组＜B组（P＜0.05）；巨噬细胞水平：A 组＞B 组＞D 组＞C 组（P＜0.05）。见表1。

表1 4 组小鼠BALF 中各类炎症细胞数目比较（±s，n = 10） ×105/mL

表1 4 组小鼠BALF 中各类炎症细胞数目比较（±s，n = 10） ×105/mL

注：与A 组比较，# P ＜0.05；与B 组比较，△P ＜0.05；与C 组比较，▲P ＜0.05

组别总细胞数嗜酸性粒细胞数中性粒细胞数淋巴细胞数巨噬细胞数A 组 3.76±0.24 0.29±0.130.28±0.090.39±0.102.80±0.19 B 组29.08±4.68#14.35±4.92#7.27±1.41#6.28±1.29#0.69±0.05#C 组 9.95±3.21#△ 3.37±0.91#△2.17±0.70#△2.09±0.31#△0.20±0.05#△D 组18.14±2.51#△▲ 7.57±0.59#△▲4.68±0.79#△▲3.18±0.24#△▲0.29±0.03#△▲F 值124.37458.313118.756134.4431422.540 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 4 组小鼠肺组织MAPK 信号蛋白表达水平比较 以β-actin 为内参对照，p-p38/β-actin 水平：A 组＝C组＜B组（P＜0.05），C组＝D组＜B组（P＜0.05），A 组＜D 组（P＜0.05）；p38/β-actin 水平：A 组＝C组＝D 组＝B 组（P＞0.05）；p-ERK1/2/β-actin 水平：A 组＜C 组＜D 组＜B 组（P＜0.05）；ERK1/2/β-actin水平：A 组＝C 组＝D 组＝B 组（P＞0.05）。见表2。

表2 4 组小鼠肺组织MAPK 信号蛋白表达水平比较（±s，n = 10）

表2 4 组小鼠肺组织MAPK 信号蛋白表达水平比较（±s，n = 10）

注：与A 组比较，# P ＜0.05；与B 组比较，△P ＜0.05；与C 组比较，▲P ＜0.05

组别p-p38/β-actinp38/β-actinp-ERK1/2/β-actinERK1/2/β-actin A 组0.60±0.070.68±0.110.19±0.051.19±0.14 B 组1.14±0.13#0.67±0.101.20±0.14#1.14±0.20 C 组0.64±0.08△0.68±0.090.69±0.08#△1.20±0.18 D 组0.72±0.10#△0.68±0.100.88±0.10#△▲1.18±0.13 F 值64.6070.025185.6970.254 P 值 0.0000.995 0.0000.858

2.4 4组小鼠BALF中细胞因子水平比较 INF-γ水平：A 组＞C 组＞D 组＞B 组（P＜0.05）；IL-4 水平：A 组＜C 组＜D 组＜B 组（P＜0.05）；IL-5 水平：A组＜C组＜B组（P＜0.05），A组＜D组（P＜0.05），C 组＝D 组（P＞0.05），B 组＝D 组（P＞0.05）；IL-17A 水平：A 组＜C 组＜D 组＜B 组（P＜0.05）。见表3。

表3 4 组小鼠BALF 中细胞因子水平比较（±s，n = 10） pg·mL-1

表3 4 组小鼠BALF 中细胞因子水平比较（±s，n = 10） pg·mL-1

注：与A 组比较，# P ＜0.05；与B 组比较，△P ＜0.05；与C 组比较，▲P ＜0.05

组别IFN-γIL-4IL-5IL-17A A 组141.27±19.85 13.08±4.12 20.13±2.65 51.09±9.88 B 组 30.14±8.53#106.83±10.49#119.64±7.58#163.27±23.42#C 组 62.59±7.64#△ 56.38±7.91#△112.34±7.16#△ 81.95±15.53#△D 组 51.37±13.86#△▲ 71.84±20.65#△▲114.86±9.51#102.62±18.71#△▲F 值131.29798.079443.95872.495 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

过敏性哮喘是哮喘中最常见的类型，遗传因素、过敏原接触等均会使其发生风险上升。西医理论认为其发病受遗传与环境的双重影响，患者在接触变应原后，体内特异性免疫球蛋白E 与肥大细胞、嗜酸性粒细胞等细胞结合，使得炎症介质分泌水平上升，进而发生哮喘[8-9]。中医理论中将此病归入“哮病”等范畴，认为其多因外感风邪、情志失畅等引起宿痰内伏于肺，以致痰阻气道，肺失肃降，肺气上逆，因此对其的治疗以治肺为主[10]。中医认为肺与大肠在经络上相互络属，功能上相互协调，因此又有“肺与大肠相表里”之论，对于肺系、肠系疾病也采用“肺肠同治”之法[11]。

本次研究结果显示，肺指数水平：A 组＜D 组＜C组＜B 组；p-p38/β-actin 及p-ERK1/2/β-actin 水平均C组、D 组明显低于B 组；INF-γ 水平：A 组＞C 组＞D组＞B 组；IL-4、IL-17A 水平均A 组＜C 组＜D 组＜B组，提示大承气汤具有与地塞米松相似的效果，能够抑制MAPK 信号通路相关磷酸化蛋白表达，减少炎症因子水平，调节Th1/Th2 平衡。MAPK 在信号从细胞表面传至细胞核内部的过程中具有重要作用，其参与到细胞的增殖、分化、炎症反应等多种重要过程中，包括ERK、p38 等4 个亚族[12]。MAPK 在碱形式中没有活性，只有经过磷酸化后其活性才会被激发。辅助性T 细胞在免疫系统中占有核心地位，包括Th1 及Th2 2 个亚群，Th1 介导细胞免疫，主要调节IFN-γ、IL-2 等水平，Th2 介导体液免疫，主要调节IL-4、IL-5等炎症因子水平[13]。一般情况下，Th1/Th2 系统处于平衡状态，当机体受到外界刺激，Th1/Th2 即会失衡，造成炎症反应[14]。大承气汤中含有大黄、枳实、厚朴、芒硝4 味中药，其中大黄具有清热泻火、泻下攻积、祛痰等功效，对于宣降肺气有所裨益；枳实能够破气消积、止咳化痰、止泻通便，厚朴能够燥湿消痰、下气平喘、行气消积，二者合用能够行气散结、平喘消痰；芒硝能够泻下通便、清火消肿，裨益大肠功能，通肺气[15-17]。现代药理学研究发现，大黄中含有β-谷甾醇、芦荟大黄素等有效成分，通过作用于钙离子、P13K、MAPK 等信号通路，能够发挥抗炎作用[18]。枳实中含有木犀草素、柚皮素等活性成分，能够作用于肿瘤坏死因子、T 细胞受体等信号通路，来发挥抗炎作用[19]。

综上所述，大承气汤能够改善过敏性哮喘小鼠肺损伤，其可能机制是抑制MAPK 信号通路磷酸化进程，调节Th1/Th2 平衡，进而减轻炎症。