局灶性脑缺血动物模型建立及评价概况

娄惠娟，丛德毓，2，张红石，蒙 蒙，李湛新，王宇峰*

（1.长春中医药大学针灸推拿学院，长春 130117；2.长春中医药大学附属医院，长春 130021）

动物造模方法的正确选择，是保证一项科研研究顺利进行的基础，脑梗死动物模型正确建立对其发病机制及判断疗效等类型的研究都具有重要意义。脑卒中可分为出血性和缺血性2 种，因缺血性脑卒中临床发病率远高于出血性脑卒中，导致目前的动物研究也多集中于缺血性脑卒中上。动物造模过程中因脑缺血时间的不同可分为永久性脑缺血和短暂性脑缺血，永久性脑缺血动物模型疾病严重程度及死亡率均较高，加之临床中患者发病后多会进行缺血的再灌注治疗，因此短暂性脑缺血应用更加广泛。根据脑梗死面积的不同，又分为全脑缺血模型及局灶性脑缺血模型，全脑缺血模型多应用于心脏骤停等导致的大面积脑损伤，临床发病原因占比较少，且动物模型死亡率高。而在局灶性脑缺血模型中大脑中动脉模型应用最为广泛。

本文就局灶性脑梗死模型动物的选择、造模方法的选择及模型建立与否的评价进行概述。

1 实验动物的选择

受到成本、伦理等的影响，啮齿动物是脑卒中研究中最常用的动物[1]。在脑卒中实验研究论文中，绝大多数使用了啮齿类动物包括大鼠、小鼠、沙鼠，其中以大鼠居多。模型动物选择大鼠一方面是因为大鼠的脑血管和生理与人类相似[2-3]，其适中的体形可以轻松监测各项生理参数；它的大脑小，非常适合固定程序（例如用于组织切片的多聚甲醛固定等）[4]，最重要的是，进行可重复的研究很容易。而对于小鼠来说更适合用于基因的研究，因为小鼠是最容易发生遗传修饰的动物[5-7]。因此大鼠、小鼠被广泛用于评估中风病理机制及治疗机制的研究中。

2 造模方法的选择

2.1 线栓法模型 在卒中研究中，最常用的体内模型之一是啮齿动物的大脑中动脉（MCA）血管内缝合或线栓模型，这会在中动脉供血区域造成可重复的梗死。通过阻塞颈总动脉（CCA），颈外动脉（ECA），将线栓直接引入颈内动脉（ICA）并推进直到中断向MCA的血液供应[8]。据梗死的时间分为短暂性大脑中动脉阻塞（tMCAO），最常见的持续时间是60 min、90 min、120 min 和永久性大脑中动脉阻塞（pMCAO）[9-12]。梗死的体积受到线栓的直径、硅酮涂层长度及插入的长度、鼠的品系（如Sprague-Dawley 较Wistar 变异性大）、再灌注的是否及时间等的影响。关于线栓进入血管的切口，经典的是Zea-Longa 报道的从ECA 切口将线栓引入，在以往的实验研究中也有较多的是从CCA 切口将线栓引入（见图1A）。2 种方法各有千秋，线栓从ECA 切口进入再灌注阶段，线栓硅胶头退回到ECA断端，不阻碍CCA 的正常供血，模型形成完全性再灌注；因CCA 较ECA 血管的走向和直径都更有利于线栓的进入，对数实验也会选择线栓从CCA 切口进去，有研究表明通过CCA 插入途径的MCAO 模型在大鼠中得到了更高的成功率[13-14]；Tsuchiya D 等的研究则表明阻断CCA血流后t MCAO 得到的梗死体积明显更大，并且梗死体积的变异性更小[15]。线栓法一般梗死涉及很大一部分的半球，包括大部分皮质，纹状体，丘脑，海马和脑室下带[16]（见图1B）。其优点包括：较低的侵入性，不需要进行开颅手术，模仿了人类的缺血性中风并有与人类相似的缺血半暗带[17]，梗死的体积较大，可重复性高，再灌注时间可控，能够用于神经保护的研究。但此方法可能会导致下丘脑的损伤发生高热反应，这在人类不多见。而且再灌注的实现更倾向于人类的机械取栓治疗过程，不适用于溶栓治疗的研究。

图1 线栓法造模方法及梗死体积示意图

2.2 开颅模型 通过外科手术，打开硬脑膜，在脑表面直接用灼烧或结扎闭塞表面血管引起局灶性的脑缺血（见图2），不发生再灌注[18]。此类方法较适用于大型动物的脑梗死，模型状态稳定，成模率高，但存在一定的脑热损伤、手术过程大脑暴露于空气中、颅内压改变等弊端。

图2 开颅法造模方法示意图

2.3 内皮素-1 注射脑卒中模型 内皮素是一种内源性长效血管收缩肽[19-20]，通过持续有效的血管收缩作用，导致局部脑血流量减少，引起短暂的局灶性脑梗死，并且经常用于模拟腔隙性中风[21-22]。这种脑缺血模型损伤程度可以根据注射部位、内皮素用药浓度及注射剂量的不同进行初步调控[23]。但随着内皮素-1 的药物代谢，作用消失，动脉逐渐恢复，并且梗死区域被重新灌注，导致不能严格控制脑缺血的持续时间。并且内皮素-1 的使用已被证明可诱导星形胶质细胞增殖，并产生允许轴突发芽的环境，这会干扰中风后的恢复机制的研究[24-25]。

2.4 光化学法卒中模型 其造模原理是通过血管注射光敏剂（如孟加拉玫瑰红、荧光素、荧光素钠、赤藓红等），在动物头部特定部位开颅骨窗，然后利用特定波长的激光器照射脑组织表面，激光与光敏剂反应释放大量活性氧自由基，导致血管内皮氧化损伤，血小板激活和聚集形成血栓[26-27]。这类模型操作相对方便，侵入性小，模型稳定，成模率成活率高，模型严重程度受到激光照射时间、不同激光强度的调控，梗死面积相对较小，集中于一个位置（见图3）。优点在于梗死灶在皮层的位置、大小是相对可控的[28-30]。也有研究结合目前光化学技术，将光纤的末端加探针，实现脑深层部位的梗死灶，不局限于大脑皮层。但其存在的缺点也很明显，首先这类模型除了人类存在的细胞毒性水肿外，还伴发血管性水肿，并迅速破坏血脑屏障；其次是迅速的终末动脉闭塞使得梗死位置发生不可逆的细胞死亡。这在一定程度上限制了模型应用于神经保护剂的研究中，而常用来研究腔隙性脑梗死及脑缺血相关的长期功能结局观察[31]。

图3 光化学法造模方法示意图

2.5 梗死性卒中模型 梗死性卒中模型造模因使用拴子材质来源的不同分为血栓梗死和非血栓梗死2 种。运用不同材质的栓子注入到ICA 或者ECA 末端中，来模拟人类的梗死性梗死。在血栓模型中，将血凝块或者血凝酶注射到脑血管中，血凝块随血流因栓子的大小、数量等导致随后的随意脑区域内发生梗死[32-33]。此类模型与人类的病理生理学情况类似，不仅可以分析具有自发恢复机制的急性期，而且可以分析慢性期。但也存在梗死的位置和梗死大小有很大的差异，闭塞物质存在无法预测的部分或完全裂解，然后再灌注，这与临床情况更为相似[34]。但也导致了各种不可控因素对实验的挑战，为此出现的特殊材质的梗死模型，一定程度上改善了标准化的问题，但也背离了临床。

2.6 模型疾病风险因素的建立 为了更好地实现模型与临床的转化，性别、年龄、基础疾病等对因素也被利用到造模中[35]。利用风险因素的干预导致自发性的中风模型，目前运用最广泛的是高血压自发中风的模型[36]。该模型与临床更加贴近但同时也大大增加科研成本。

3 神经行为学评定

3.1 神经功能缺损评分 神经功能缺损评分是评价模型成功与否的最简便的方法。包括Zea-Longa 评分法、Bederson 评分、神经功能缺损评分（neurological severity scores，NSS）、 改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score，mNSS）、Belayev 评分等[37-39]。目前应用较为广泛的就是Zea-Longa 评分法，这些方法更多地关注了运动方面的评估。为了能够更加全面地评估模型的运动感觉及认知缺损情况，同时还需要对模型进行更加精细和有针对性的行为学变化观察。

3.2 感觉运动类行为学评估 模型不同的梗死部位会表现出不同的行为学变化，额叶皮质的梗死主要变现为运动能力的下降，而顶叶皮质或丘脑的梗死会出现感觉的异常，对感觉运动的复杂行为学变化的评估包括平衡木行走实验、转棒实验、肢体放置实验、网屏实验、胶带摘除实验、跑梯试验及相应的改良实验，针对性的评估模型的平衡性、肌肉力量、感觉异常、异常行为活动等[40-42]。

3.3 学习记忆类行为学评估 认知的形成是一个复杂的回路共同作用产生的，在回路中的任何一部位的梗死灶都会导致模型学习记忆功能障碍，不论是浅层的皮质还是深层的海马出现缺血梗死都会对认知产生影响。对于认知的评估多是利用大鼠的不同生活喜好设计了不同实验，包括各种迷宫类，其中有利用大鼠恶水性的morris 水迷宫[43-44]及加以变换的放射臂水迷宫，利用大鼠避光避噪的巴恩斯迷宫[45]，食物诱导性的T迷宫、Y 迷宫。除此外还利用啮齿类动物喜欢探索陌生事物的天性设计的新物体识别实验，利用强刺激如点击和噪音等设计的穿梭箱实验、避暗实验[46]、跳台实验等。Morris 水迷宫实验是目前最常应用于检测和评估模型学习及记忆能力的方法。

4 常用脑组织病理学评估

对于局灶性脑缺血模型的评估，脑组织的病理学染色也常被联合运用。常见的如2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色[47]、尼氏染色[48]、苏木精-伊红（HE）染色、Fluoro-JadeB（FJB）荧光染色、镀银染色、高尔基染色（golgi-cox）以及透射电镜观察神经元亚细胞结构等[49]。TTC 染色将活细胞染成红色，因其便捷、费用低等优点被广泛运用于脑卒中急性期脑梗死体积的评价。HE 染色、尼氏染色主要能显示出梗死细胞的形态变化特征、尼氏小体的多少。高尔基染色能够将神经元树突棘突的形态多少变化显现出来。而想要观测亚细胞架构就需要使用电镜，来观察线粒体、内质网等的超微结构。

5 影像学检查

模型造模后使用MRI 检查[50]、CT 检查等，能直观地检测出脑缺血，并且MRI 的灵敏度高，能够发现超早期的脑缺血病灶[51]，也可以采用动脉自旋标记灌注磁共振成像技术、激光多普勒血流监测[52]、激光散斑成像技术[53-54]等技术对模型进行脑血流监测，这类检测相较于行为学检测更加精确直观，相较于病理染色不需要处死模型，不影响后续的实验研究。

6 小结

上述检测技术用来检测功能的缺损情况，问题是啮齿动物比人类有更大的恢复潜力。同时动物自身的认知与感觉运动也存在相互影响，许多行为学实验与病理学检测结果显示的梗死体积及位置会存在偏差。因此较为合理的实验设计常为选择多种手段联合使用，多种行为学方法联合使用，并结合病理学、影像学等来综合评估神经缺损情况。