LC-MS/MS法测定网售外用乳膏中的10种抗菌药物

李冬云 陈思婷 陈立波 周 颖 卢森华

（1.玉林市食品药品检验检测中心，玉林中药材（含香辛料）质量监测与评价工程技术研究中心，玉林 537000；2.桂林医学院，桂林 541199）

近年来，随着人民物质生活水平有所提升，对皮肤类产品的需求也日益提高，许多网售的宣传可以治疗手足藓、皮疹、脚气等止痒抑菌外用乳膏都被赋予除痒止痒、抑菌杀菌、保湿滋润的希望和功效。网售的外用乳膏大多为消字号产品，价格低廉、购买和使用方便、针对性强，民众广泛接纳，因此不法经营者通过在其产品中添加抗菌药品来达到快速治疗的目的。但随着监管的要求和对质量安全的重视，更多的消费者期望能使用到有效且安全的外用乳膏。

外用乳膏添加的抗菌药物包括抗真菌类、抗生素类等，检测方法主要有液相质谱联用法和液相法[1-8]等，液相法仅靠保留时间定性，抗干扰能力差且灵敏度低，较难满足非法添加组分残留检测要求。液质法可同时测定多个目标物，具有高选择性、高灵敏度、高通量的优势，可弥补液相方法的不足，因此该技术在药品安全分析中得到广泛应用。氟康唑、酮康唑、萘替芬、联苯苄唑、克霉唑、益康唑、灰黄霉素、咪康唑 、特比萘芬是在外用乳膏中是最常发现的非法添加抗真菌类药物，莫匹罗星是常见的外用抗生素，这10种抗菌药物在临床上对治疗皮肤湿疹、皮炎、瘙痒等效果较好，但是如果长期使用会产生耐药性和身体危害。其中陆林玲[9]等建立的超高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中38种抗菌药，沙丽娜[10]等建立的液质联用法测定化妆品中16种抗菌药物，主要研究的是抗生素类和抗真菌类成分，并未涵盖特比萘芬和莫匹罗星，且磺胺类和喹诺酮类等抗生素鲜有添加。现有方法未能同时涵盖这10种药物，本实验在上述检测方法的基础上，采用HPLC-MS/MS法，多反应监测，更有针对性的实现快速准确测定外用乳膏可能添加的10种抗菌药物，为其以及相关产品中的非法添加抗菌药物的监测提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氟康唑等8种（氟康唑、酮康唑、萘替芬、联苯苄唑、克霉唑、益康唑、咪康唑、灰黄霉素）混合标准品溶液，浓度100 μg/mL，批号:S074153，Medjen迈迪嘉（天津）科技有限公司；盐酸特比萘芬，批号：NL201104-10，斯坦福化学公司，含量98.13%；莫匹罗星，130568-202102，中国食品药品检定研究院，含量100%；甲酸：优级纯，上海安谱科科学仪器有限公司；乙腈，色谱纯，Merck公司；水为超纯水；其它所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

液相色谱-质谱联用仪：Xevo-TQ-Smicro型，美国沃特世公司；电子分析天平：XS-205DU型，感量为0.01 mg，梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；数控超声波清洗器：KQ-250DB型，昆山市超声仪器有限公司；超纯水仪：Milli-Q型，美国Millipore公司；可调量程移液枪：量程为100 μL～1000 μL、10μL～100μL，赛默飞公司。

1.3 样本来源

实验中使用的外用乳膏，随机采购于网络销售平台，共47批，涵盖婴幼儿湿疹产品和草本类止痒抑菌类产品等，样品编号为1～47。

1.4 试验方法

1.4.1 标准溶液配制

标准储备溶液的配制：分别精密称取莫匹罗星对照品11.53 mg、盐酸特比萘芬对照品17.25 mg分别置于不同的50 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为单标储备液；分别精密量取莫匹罗星对照品单标储备液、盐酸特比萘芬单标储备液各0.5 mL置于同一个50 mL量瓶中，加乙腈稀释配制成2种成分的混合标准储备溶液；精密量取氟康唑等8种混合标准品溶液（100 μg/mL）1.00 mL至20 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为另外8种成分的混合标准储备溶液。

标准工作溶液：使用可调量程移液枪(量程分别为:100 μL～1000 μL、10 μL～100 μL)分别精密量取莫匹罗星和盐酸特比萘芬的混合标准储备液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1 mL，及另外8种成分的混合标准储备溶液0.04 mL、0.08 mL、0.16 mL、0.32 mL、0.4 mL分别置于5个10 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为系列标准工作溶液。

1.4.2 样品制备

称取供试品0.5 g置于50 mL离心管，加饱和NaCl 1 mL，涡旋30 s，加入乙腈20 mL，涡旋30 s，超声处理30min，放冷至室温，最后用乙腈定容至刻度，以5000r/min离心5 min，上清液经0.22 μm滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。

1.4.3 色谱-质谱条件

色谱条件：色谱柱为phenomenex Kinete C18（100mm × 4.6 mm × 2.6 μm）; 柱温：35℃；进样体积：5 μL；流动相：A相为0.1%甲酸溶液，B相为乙腈，流量为0.3 mL／min，梯度洗脱，洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱程序

质谱条件：离子模式： ES+：;毛细管电压：2.50kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：500 ℃；锥孔气流速：20 L/h；脱溶剂气流量：1000 L/h。表2列出了多反应监测扫描参数。

表2 多反应监测扫描参数

2 结果与讨论

2.1 液相色谱-质谱条件的优化

基于10种成分中，氟康唑、酮康唑、联苯苄唑、克霉唑、益康唑、咪康唑为三唑类结构，萘替芬和特比萘芬为烯胺类结构，灰黄霉素为多烯类结构，莫匹罗星疏水性较强，这些成分均微溶于水或难溶于水，易溶于甲醇和乙腈的物理性质，所以实验选择了反相色谱常用的流动相体系甲醇-水和乙腈-水。又考虑到在质谱正离子模式下，甲酸可使目标物形成［M+H］+，有助于促进质子离子化，从而提高分析灵敏度。因此本实验着重考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时各物质的分离效果。实验结果表明，乙腈-0.1%甲酸水流动相体系效果最佳，灵敏度更高，且峰形尖锐对称，分离度好；因此本实验选用乙腈-0.1%甲酸水作为最佳流动相体系。在优化色谱条件下，10种组分的总离子流色谱图见图1。

图1 10种组分的总离子流图

用标准储备溶液在流动注射泵进样方式下，在电喷雾离子源的正离子模式和负离子模式下，分别对质量浓度为2 μg/mL混合标准溶液进行一级质谱全扫描分析，获得准分子离子或加合离子。扫描结果表明：在负离子模式下大部分目标物质离子的相对丰度多数不到正离子模式下的1/2；因此，实验在正离子模式下进一步优化质谱条件，通过改变碰撞能量和锥孔电压，选择信号较强、干扰较小的子离子对，其中丰度相对较大的为定量离子，另一个为定性离子。

2.2 标准工作曲线、检测限及定量限（表3）

表3 10种药物的线性范围、回归方程、检出限与定量限

2.3 回收率

称取外用乳膏阴性样品9份，分别添加3个浓度水平，每个水平添加3个平行，按照1.4.3的方法测定10种药物的浓度，加标回收率及其相对标准偏差，见表4。由结果看出，该方法的准确性良好。

表4 3个水平浓度添加回收率试验结果

2.4 精密度试验

取外用乳膏阴性样品，加入浓度约为3 μg/mL的莫匹罗星和特比萘芬混合储备液和浓度为5 μg/mL的其余8种成分的混合储备液各1 mL，按照“ 1.4.2 ”进行前处理，平行测定6次，记录峰面积，结果显示氟康唑、酮康唑、萘替芬、联苯苄唑、克霉唑、益康唑、灰黄霉素、咪康唑 、特比萘芬、莫匹罗星的峰面积的精密度RSD为1.67%、1.18%、1.04%、0.86%、0.83%、1.02%、1.30%、0.98%、0.48%、0.62%，表明该方法精密度良好。

2.5 重复性试验

取外用乳膏阴性样品6份，加入浓度约为3μg/mL的莫匹罗星和特比萘芬混合储备液和浓度为5 μg/mL的其余8种成分的混合储备液各1 mL，按照“ 1.4.2 ”进行前处理，制成6份样品溶液，按“ 1.4.3 ”中的方法进行测定，记录峰面积，结果显示氟康唑、酮康唑、萘替芬、联苯苄唑、克霉唑、益康唑、灰黄霉素、咪康唑、特比萘芬、莫匹罗星的精密度RSD%为0.60%、0.46%、1.86%、1.22%、1.65%、1.18%、1.34%、0.92%、1.64%、1.49%，表明该方法重复性较好。

2.6 定性确证

本试验采用样品保留时间与标准物质保留时间一致（保留时间偏差在±2.5%范围内），且定性与定量离子对相对离子丰度比满足表5要求，判定为检出。

表5 相对离子丰度比最大允许偏差

2.7 样品测定结果

应用本方法对网售的47批外用乳膏进行了分析测定，其中1批检出灰黄霉素、1批检出酮康唑、16批检出咪康唑、2批检出联苯苄唑、10批检出特比萘芬，检出率如图2所示，由图可知，网售47批外用乳膏检出率较高前3种组分依次为为咪康唑、特比萘芬、联苯苄唑，其中咪康唑检出率高达34%；检出的含量均较高，甚至高达毫克级别，具体数值见表6。

图2 检出组分及检出率%

表6 样品检出情况

mg·g-1

3 结语

采用液相色谱仪串联质谱法，对网售外用乳膏中的10种抗菌药物进行快速定量定性分析。本方法灵敏度高，专属性强，能准确定量并同时测定多种药物，满足目标分析物的定性和定量要求，为开展网售外用乳膏非法添加的检测及风险评估，加强化妆品质量监管提供技术支持。