近红外光谱法快速鉴别伪品立普妥方法的研究

赵玉泉 韩吴琦 张 峰 李习莹 谢晓燕

（开封市食品药品检验所，开封 475000）

阿托伐他汀钙片是最常用的降脂药物之一，以2017～2019年度天津某医院数据统计为例，在降脂类药物中，立普妥用量连续3年呈逐年上升趋势[1]。近年来，市场监管部门屡次发现制售假冒立普妥的案例，严重损害了患者的利益，给药品安全造成危害。目前，市场监管定性判定真假药品通常采用高效液相色谱法，存在预处理麻烦、使用大量的有机试剂、对环保不友好等问题，大规模筛查伪品耗费时间长，无法满足药品现场快速检测的需求[2]。

近红外技术是一种简便快速的绿色分析技术，已被广泛应用于制药、农业、食品以及医学等各个领域[3-7]。近红外光谱是物质分子指纹图谱，药品光谱包含有效成分、辅料以及包装等所有信息，是药品检验、药物鉴定中一种有效手段，也用于检测药品中非法添加成分、原料污染或物料配比异常等情况。

本研究运用药品快检车上的车载傅里叶近红外光谱仪，采用一致性验证方法建立伪品立普妥鉴别模型，用于快速筛查出伪品立普妥，同时也能准确区分不同厂家的阿托伐他汀钙片，为解决阿托伐他汀钙片质量现场监管提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

1.1.1 试剂

乙腈，四氢呋喃（色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司）；枸橼酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为超纯水。

1.1.2 试药

阿托伐他汀钙对照品（纯度，94.9%，中国食品药品检定研究院，批号100590-201804）；收集市售阿托伐他汀钙片样品，共70批次，规格均为10 mg/片，疑似伪品立普妥2批（批号X47646，X88639），药品来源详细见表1。

表1 不同厂家阿托伐他汀钙片

1.2 仪器与条件

1.2.1 仪器与设备

高效液相色谱仪（e2695，Waters公司，美国），配DAD检测器；分析天平（MS205DU，梅特勒-托利多，瑞士）；傅里叶变换近红外光谱仪（MATRIX-F，布鲁克公司，德国），配漫反射光纤探头附件，光谱处理软件OPUS 5.0。

1.2.2 仪器条件参数

（1）液相色谱仪：反相色谱柱C18(5 μm，4.6mm×150 mm, Thermo Syncronis)；流动相：乙腈-四氢呋喃-0.05 mol·L-1枸橼酸铵溶液（pH值为4.00，27∶20∶53）；检测波长：244 nm；进样体积均为10μL。

（2）近红外光谱仪：波数范围为4000 cm-1～12000 cm-1，漫反射测定，分辨率为8 cm-1，扫描次数为32次，环境温度：20 ℃～25 ℃，空气相对湿度：30%～35%。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理-高效液相色谱检测

取适量样品，混合均匀，研细，精密称取（约相当于阿托伐他汀钙10 mg），置100 mL 量瓶中，加混合溶液：乙腈-0.05 mol·L-1枸橼酸铵溶液（pH 值为7.40，1∶1），溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液备用；取阿托伐他汀钙对照品约10 mg，精密称重，加上述混合溶液定容至刻度，作为对照品溶液备用。

1.3.2 鉴别真伪立普妥-高效液相色谱法

疑似假冒立普妥样品采用高效液相色谱法进行初筛，参照阿托伐他汀钙片现行标准（YBH19122005-2014Z）[8]进行鉴定。精密吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，以保留时间定性鉴定。

1.3.3 光谱采集方法

每批次样品各取7片，用光纤探头抵住药片，按设定参数采集70批次样品光谱，共得到490张样品光 谱。

1.3.4 一致性检验原理与评价方法

本研究采用一致性检验的原理进行样品一致性判别，该原理通过计算参考样品集光谱上每个波长点的漫反射吸光度平均值和标准偏差σ，并以此波长点吸光度的平均值加或减一定倍数（CI值）的标准偏差作为该波长点的可信区间，以CI值作为一致性检验的限度值；一致性检验过程是将待测样品光谱的吸光度值与参考光谱吸光度平均值的差值除以标准偏差σ，得到该未知样的一致性指数CI，即第i个波长点的CI值：

在谱段内所有波长点的吸光度总体上达到0.9999 概率下均不超限度，CI 值在Excel中的计算命令是TINV( ( 1～0. 9999 ^( 1 /a) ) ，( b-1) ) ，式中a是波长点数，b是参考光谱数量)[9]。

该待测样CI与参考光谱集CI限度值进行比较，判定待测样光谱与参考光谱是否一致；如CI值≤CI限度值，则表示通过一致性检验；如CI值＞CI限度值，则判定样品不一致。不同波长点CI值不同，一般取重要波长范围建立模型，也可以采用全光谱范围来建模，以最大CI值（最大一致性指数max CI值）来进行比较，判断是否满足上述条件。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱法鉴定真伪阿托伐他汀钙

图1为阿托伐他汀钙对照品、立普妥（批号8173）、2个疑似伪品立普妥以及其他厂家制剂优力平的液相色谱图。从图中看出，阿托伐他汀钙对照品和真品立普妥以及优力平样品中的有效成分色谱保留时间均在15.92 min附近，而伪品立普妥在该保留时间未出峰，依此确定两个疑似样品是伪立普妥。

图1 阿托伐他汀钙对照品和真伪立普妥样品液相色谱图

2.2 近红外光谱法快速鉴别真伪立普妥

2.2.1 真伪立普妥的近红外光谱

图2 为真、假样品的近红外光谱，从图2可以看出，立普妥真品在4029 cm-1、4764 cm-1、5175 cm-1附近有强吸收峰，而伪品在5715 cm-1和6861 cm-1有两个尖锐吸收峰，光谱差异较大，光谱特征明显不同，因此可以通过图谱比对直观区别真、假立普妥。但是考虑到监管一线使用人员识别近红外光谱存在一定的困难，为了方便使用，提高方法的可靠性，本研究采用一致性原理建立了算法模型判定的方法。

图2 真、伪品立普妥近红外光谱图

2.2.2 建立真伪立普妥的近红外光谱判别方法

（1）光谱预处理

由于近红外光谱峰形较钝、重叠严重，且含有目标成分外其它成分的信息，例如辅料、光的散射、杂散光和噪声等，这些因素导致光谱图基线漂移，影响光谱的重复性和准确性。对光谱进行适当的预处理，能够降低或者消除无关信息和噪声对光谱的影响[10]。不同样品在9000 cm-1～7400 cm-1、7000 cm-1～5600 cm-1、5100 cm-1～4000 cm-1区域吸收峰有明显区别，而且这3个谱段分别是CH、NH和OH的合频和倍频吸收，信息量丰富，所以建模时选取这3个波段。

本研究选择一阶导数（17点）结合矢量归一化预处理方法，不同厂家阿托伐他汀钙片（真品）光谱处理后如图3所示，从图中可以看出，经过预处理后，不同样品光谱基线基本重叠，光谱一致性较好。

图3 不同厂家阿托伐他汀钙片特征光谱（一阶导数结合矢量归一化）

（2）鉴别一致性验证模型建立与验证

将样品光谱进行一阶导数（17点）结合矢量归一化预处理后，建立一致性模型。以15批次立普妥样品共计105张光谱作为参考集，建立一致性验证模型，将其他4个厂家（55批次）阿托伐他汀钙制剂样品共计385张光谱作为验证集，验证结果见图4。建模选取9000 cm-1～7400 cm-1、7000 cm-1～5600 cm-1、5100 cm-1～4000 cm-13个谱段，在分辨率为8 cm-1时共计512个波长点，参考光谱为105张，根据1.3.4中计算公式得到CI值应设定为5.6。从图上可以看出其他4个厂家55批次样品光谱的CI 值都大于5.6但小于30.7，差异明显，分离效果良好。将2批次伪品立普妥共14张光谱作为未知样，一致性结果见图5，CI值远大于5.6，也远大于30.7，明显异于参考光谱，模型判别该样品为伪品立普妥，该结果与高效液相色谱判定的一致。

图4 不同厂家阿托伐他汀钙片模型验证结果横坐标为光谱数量，纵坐标为最大CI 值

图5 伪品立普妥判别结果横坐标为光谱数量，纵坐标为最大CI 值2.2.4讨论

2.2.3 讨论

本研究建模针对的是特定厂家、特定规格的产品，进一步研究可以收集更多不同厂家的各种规格的制剂，调整模型参数，优化模型使其应用范围更广。另外也可以尝试建立近红外光谱定量模型，用来快速测定阿托伐他汀钙制剂的含量均匀度或溶出度项目。

3 结论

针对伪品立普妥包装、药片性状上与真品无明显差异，执法人员难以从外观上判断真假的问题，采用近红外光谱法建立了真伪立普妥一致性检验模型，模型对伪品立普妥鉴别的正确率为100%，对两个伪品立普妥判别结果与液相色谱法一致，结果表明近红外光谱法可以快速鉴别出伪品立普妥，且方法简便快速，检测成本低，可以实现现场无损检测，大大提高药品流通市场监管工作时效性，为净化药品市场提供了有力的技术支撑。