盐酸特比萘芬包合物脂质体的制备*

闫梦茹，罗国平，张文博，王小宁，陈 程

（1.西安医学院 药学院，陕西 西安710021；2.浙江温州轻工研究院，浙江 温州325003；

3.陕西科技大学 陕西省轻化工助剂化学与技术协同创新中心，陕西 西安710021）

盐酸特比萘芬作为一种抗真菌药，具有疗效佳，毒性低等优点。既可口服也可外用[1]。在外用时，可渗透到达角质层，与皮肤角质层细胞紧密结合发挥药效[2]，而对于深部真菌性皮肤感染疾病，则需采用口服与外用制剂联用治疗。由于盐酸特比萘芬水溶性较差，体内吸收转运困难，口服不良反应严重[3]。所以寻找一种能将盐酸特比萘芬送到皮肤深层并能起到长效缓释作用的给药系统迫在眉睫。

包合技术是利用主分子较大空穴将客分子包嵌，从而形成分子胶囊包合物的技术，可提高难溶性药物的溶解度和稳定性[4]。羟丙基-β-环糊精（HPβ-CD）是一种常用的包合材料，具有中空圆筒状结构，圆筒内疏水，圆筒外亲水。以HP-β-CD为包合辅料，将盐酸特比萘芬包合在HP-β-CD的圆筒结构内，有效的提高其在水中溶解性，改善其生物利用度。

脂质体是由胆固醇和磷脂组成的具有高生物相容性的载药系统，因在结构中含有疏水体膜和亲水内核，可同时载亲水及亲脂成分[5-7]，故分别将亲水性成分盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物包裹于脂质体内水相中，将亲脂性成分盐酸特比萘芬包裹于磷脂双分子层中。磷脂双分子层中的盐酸特比萘芬最先释放，内水相中的包合物作为药库，缓慢释放药物，从而达到长效缓释的作用，本文将对盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂质体的制备工艺进行研究。

1 实验部分

1.1 试药

盐酸特比萘芬对照品（生产批号170105武汉拉那白医药化工有限公司）；胆固醇（生化剂 东巨荣生物工程有限公司）；吐温-80（CP天津市科密欧化学试剂有限公司）；95%乙醇、1,2-丙二醇、NaH2PO4、Na2HPO4、冰乙酸均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；三乙醇胺（AR天津市富宇精细化工有限公司）；甲醇、三乙胺（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1.2 仪器

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；Agilent Tech.1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；TG-1650-WS型台式高速离心机，SB-5200DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；BT125D型电子天平（赛多斯科学仪器(北京)有限公司）

1.3 筛选盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物的制备工艺

1.3.1 盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物的制备方法 在室温条件下，称取13g HP-β-CD，加到40mL的纯化水中制备量HP-β-CD饱和溶液。再向HPβ-CD饱和液中缓慢滴加盐酸特比萘芬乙醇溶液，边加边超声，超声一定时间后冷冻干燥。最后加石油醚多次洗涤干燥物并快速抽滤，烘干，即得到白色粉末状包合物。

1.3.2 单因素实验

（1）主客分子比对包合率的影响 分别选取盐酸特比萘芬与HP-β-CD质量比为1∶10、1∶13、1∶15、1∶20，其他条件不变，分别制备盐酸特比萘芬HPβ-CD包合物并测定包合率。

（2）超声时间对包合率的影响 分别选取超声时间20、30、40min，其他条件不变，分别制备盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物并测定包合率。

（3）超声温度对包合率的影响 分别选取超声温度30、40、50、60℃，其它条件不变，分别制备盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物并测定包合率。

1.4 优化盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂质体的制备工艺

1.4.1 乙醇注入法制备盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂质体 精密称取一定量的卵磷脂、胆固醇置于烧杯中，加入一定量无水乙醇，超声溶解，加入盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物，在30℃、20r·min-1条件下，用注射器缓慢注入一定量磷酸盐缓冲液（PBS），并继续搅拌25min，超声2min，冷却至室温，即得到盐酸特比萘芬包合物脂质体，置4℃冰箱保存备用。

1.4.2 单因素考察

（1）药脂比对包封率的影响 分别选取主药与卵磷脂的比例为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8，其他条件不变，分别制备盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂质体并测定包封率。

（2）卵磷脂与胆固醇的比例对包封率的影响 分别选取胆固醇与卵磷脂的比例为1∶1、1∶3、1∶5、1∶6，其他条件不变，分别制备盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂质体并测定包封率。

（3）超声时间对包封率的影响 称取主药0.03g，胆固醇0.04g，卵磷脂0.12g，超声时间分别选取2，4，6，8min，其他条件不变，分别制备盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂质体并测定包封率。

（4）搅拌时间对包封率的影响 称取主药0.03g，胆固醇0.04g，卵磷脂0.12g，搅拌时间分别选取5，15，25，35，45min，其他条件不变，分别制备盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂质体并测定包封率。

（5）醇相含量对包封率的影响 称取主药0.03g，胆固醇0.04g，卵磷脂0.12g，分别取醇相含量为30%、40%、50%其他条件不变，制备盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂质体并测定包封率。

1.4.3 正交试验优化处方 由上述单因素的实验结果可知，对盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂质体包封率影响较大的因素有3个，即药脂比（A）、胆固醇与磷脂的比例（B）、搅拌时间（C）。故正交试验将以包封率为评价指标，选用L9（34）正交试验，对这3个因素进行考察，具体实验分组见表1。

表1 正交试验表Tab.1 Table of orthogonal test

1.5 HPLC法测定盐酸特比萘芬含量方法学考察[8,9]

1.5.1 溶液的配制

（1）对照品溶液的配制 精密称取盐酸特比萘芬对照品6mg，置25mL容量瓶中，用甲醇20mL超声溶解，并定容至刻度，摇匀即得（浓度：0.24mg·mL-1）。

（2）供试品溶液的配制 取盐酸特比萘芬HPβ-CD包合物脂质体溶液5mL，3000r·min-1离心20min，取上清液置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀即得。

（3）空白溶液的配制 制备不加盐酸特比萘芬的HP-β-CD包合物脂质体，照“1.5.1（2）”项下方法操作。

1.5.2 色谱条件的建立 色谱柱：Agilent 5 TC-C18250×4.6mm，流动相：甲醇-水-三乙胺溶液（0.1%三乙胺溶液，用HAc调pH值至7.5）（95∶1∶4），检测波长：282nm，流速：1.0mL·min-1，柱温：20℃，进样量：20μL。

1.5.3 专属性实验 分别取对照品、供试品、空白溶液各1mL，过0.45μm微孔滤膜，并进样20μL，按照“1.5.2”项下色谱条件进行分析，记录色谱图（图9）。

1.5.4 线性关系考察 分别精密吸取“1.5.1（1）”项下盐酸特比萘芬对照品溶液0.2、0.6、1、2、5mL，置5mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得不同浓度的溶液，各取1mL过0.45μm微孔滤膜，并进样20μL，记录峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归。

1.5.5 精密度试验 吸取“1.5.1（1）”项下盐酸特比萘芬对照品溶液1mL，过0.45μm微孔滤膜，并精密吸取20μL注入高效液相色谱仪，按“1.5.2”项下的色谱条件进行测定，并连续进样6次，计算RSD值。

1.5.6 重复性试验 照“1.4”项下制备脂质体的方法平行制备样品溶液6组，并按照“1.5.1（2）”项下处理样品，吸取盐酸特比萘芬供试品溶液各1mL，过0.45μm微孔滤膜，并精密吸取20μL样品通过“1.5.2”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图中峰面积并计算RSD值。

1.5.7 稳定性试验 将同一组盐酸特比萘芬供试品溶液放置在常温环境中，分别在0、1、2、4及6h取1mL，过0.45μm微孔滤膜，并精密吸取20μL注入高效液相色谱仪，按“1.5.2”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图中盐酸特比萘芬峰面积，根据峰面积计算RSD。

1.5.8 加样回收试验 分别取已知含量的盐酸特比萘芬供试品溶液9份，再加入其所含盐酸特比萘芬含量的80%、100%、120%的对照品，按“1.5.2”项下的色谱条件进行测定，并分别计算加样回收率和RSD。

2 结果与讨论

2.1 盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物的单因素实验结果

（1）主客分子比对包合率的影响 如图1所示，随着主客分子比例的增加，包合率先逐渐增大再缓慢降低，当HP-β-CD与盐酸特比萘芬比例达到13∶1时，包合率达到最大。包和率没有随HP-β-CD的增加一直增加，可能是因为当HP-β-CD在溶液中达到一定浓度会发生分子间的相互作用，且趋势会不断加强，从而影响了盐酸特比萘芬分子进一步进入HP-β-CD的分子腔，因此，盐酸特比萘芬的包合率不会持续增加[10]。

图1 主客分子对包合率的影响Fig.1 Effect of host and guest molecules on inclusion rate

（2）超声时间对包合率的影响 如图2所示，随着超声时间的增加，包合物的包合率先增加后逐渐降低，当超声时间达到30min时，包封率最大。

图2 超声时间对包合率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on inclusion rate

（3）超声温度对包合率的影响 如图3所示，随温度上升，盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物包合率先增加后降低，当包合温度达到40℃时，包合率最大。

图3 超声温度对包合率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on inclusion rate

2.2 盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂质体的单因素考察

（1）药脂比对包封率的影响 如图4所示，当卵磷脂的用量逐渐增大时，包封率明显增加，但当卵磷脂大于盐酸特比萘芬6倍时，包封率又减小，包封率在药脂比达到1∶6时最大。

图4 药脂比对包封率的影响Fig.4 Effect of drug-to-lipid ratio on encapsulation efficiency

（2）卵磷脂与胆固醇的比例对包封率的影响 如图5所示，当卵磷脂的用量逐渐增大时，包封率明显减小，包封率在胆固醇与卵磷脂比例达到1∶1时最大。

图5 胆固醇与卵磷脂的比例对包封率的影响Fig.5 Effect of the ratio of cholesterol to lecithin on the encapsulation efficiency

（3）超声时间对包封率的影响 如图6所示，随着超声时间逐渐增加，包封率变化并不明显，由此可见，超声时间对包封率基本没影响。

图6 超声时间对包封率的影响Fig.6 Effect of ultrasound time on encapsulation rate

（4）搅拌时间对包封率的影响 如图7所示，包封率随搅拌时间的增加先增加后减小，当搅拌时间在25min时，包封率最大。当搅拌时间超过25min包封率减小，可能是因为搅拌时间过长，破坏脂质体结构。

图7 搅拌时间对包封率的影响Fig.7 Effect of mixing time on encapsulation rate

（5）醇相含量对包封率的影响 如图8所示，随着醇相含量的逐渐增加，包封率逐渐减小，但影响并不大。

图8 醇相含量对包封率的影响Fig.8 Influence of alcohol content on encapsulation efficiency

2.3 正交试验优化处方

表2 正交试验结果Tab.2 Results of orthogonal test

由表2可知，对盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂质体的包封率的影响因素大小排序为：A＞C＞B，即药脂比＞搅拌时间＞胆固醇与磷脂比；最佳搭配为A2B2C2，即囊材主药比（卵磷脂∶胆固醇∶主药）为6∶2∶1，搅拌时间为25min。

表3 方差分析Tab.3 Results of variance analysis

由表3中的方差分析可知，在a=0.05条件下，这3个因素无显著性差异。

2.4 HPLC法测定盐酸特比萘芬含量方法学考察

2.4.1 专属性考察 对照品、供试品、空白溶液的色谱图如图9所示，表明辅料对主药的测定无干扰，方法专属性良好。

图9 色谱图Fig.9 Chromatograms

2.4.2 线性关系考察 以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标的线性方程为Y=14900X+16.324，R2=0.9997，说明盐酸特比萘芬在0.0096～0.24mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.4.3 精密度试验 连续进样6次峰面积的RSD值为2.30%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验 平行制备6组样品的峰面积的RSD值为2.6%（n=6），表明本测定方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验 盐酸特比萘芬溶液在0、1、2、4及6h的峰面积的RSD值为3.19%（n=5），表明盐酸特比萘芬供试品溶液中药物在6h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收试验 平均加样回收率为95.7%，RSD为1.92（n=9）。

3 结论

通过单因素实验筛选出盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物的工艺条件为主客分子比为1∶13，超声时间为30min，超声温度为40℃；再通过考察单因素结合正交试验得到制备盐酸特比萘芬HP-β-CD包合物脂质体的最优制备条件是磷脂-胆固醇-主药比为6∶2∶1，醇相含量30%，超声时间4min，搅拌时间25min。

将盐酸特比萘芬制成包合物脂质体给药系统，不仅可以增加盐酸特比萘芬载药量、提高药物作用浓度，还能加大盐酸特比萘芬透皮深度、增大表皮真皮层内药物的滞留量，使得药物副作用小，作用持久且疗效佳。这种将包合技术和脂质体载药透皮技术结合起来的新型药物载体，为皮肤外用给药提供一种新剂型，对皮肤病防治具有重要的意义。