Neuritin相互作用蛋白的筛选与分析鉴定

朱金辉　朱井玲　刘春燕　董鸿昌　朱礼彦　魏韬艺　黄瑾

摘要：目的 筛选及分析鉴定与 Neuritin 相互作用的候选膜蛋白，为探讨 Neuritin 发挥生物学作用的分子机制提供理论基础。方法 首先利用免疫荧光明确 Neuritin 在细胞的定位情况；基于表面等离子共振传感（Surface plasmon resonance， SPR）技术，利用 Neuritin 蛋白直接捕获与 Neuritin 相互作用的蛋白复合物，质谱分析筛選出可能与Neuritin相互作用的靶标蛋白；通过生物信息学对靶标蛋白进行细胞组分、生物过程、功能以及参与的信号通路进行富集分析；为了缩小验证范围，进一步利用甲醛交联法捕捉与 Neuritin 相互作用的蛋白，通过以上方法综合分析，确定与 Neuritin 相互作用的蛋白;利用免疫荧光及免疫共沉淀方法对 Neuritin 与捕获蛋白在 SH－SY5Y 细胞中的相互作用进行验证。结果 基于 SPR 技术筛选到 172 条可能与 Neuritin 相互作用的蛋白，通过质谱与生物信息学分析，确定 ANXA2 为候选与 Neuritin 相互作用的蛋白，经过免疫荧光和免疫共沉淀验证 Neuritin 与  ANXA2 存在相互作用。结论 筛选出与 Neuritin 相互作用的候选蛋白 ANXA2，二者在SH-SY5Y细胞上共定位且具有特异性的相互作用。

关键词：Neuritin；ANXA2；蛋白质相互作用；生物信息学分析；质谱技术

中图分类号：R34中图分类号文献标志码：A文献标识码

Screening， analysis and identification of Neuritin interacting proteins

ZHU  Jinhui，ZHU  Jingling，LIU  Chunyan，DONG  Hongchang，ZHU  Liyan，WEI  Taoyi，HUANG Jin*

（Department of Biochemistry， School of Medicine， Shihezi University/Key Laboratory of Xinjiang Provincial and Ethnic

High Morbidity， Ministry of Education，Shihezi，Xinjiang 832002， China）

Abstract：  Objective To screen， analyze and identify candidate membrane proteins interacting with Neuritin， and to provide a theoretical basis for exploring the molecular mechanism of biological effects of Neuritin.Methods Firstly， Neuritin was localized in cells by immunofluorescence. Based on Surface plasmon resonance （SPR） technology， Neuritin protein is used to directly capture protein complexes interacting with Neuritin， and target proteins that may interact with Neuritin are screened out by mass spectrometry. The cellular components， biological processes， functions and signaling pathways involved in the target proteins were enriched and analyzed by bioinformatics. In order to narrow the verification range， the protein interacting with Neuritin is further captured by formaldehyde crosslinking method， and the protein interacting with Neuritin is determined by comprehensive analysis of the above methods. The interaction between Neuritin and the capture protein in SH－SY5Y cells was verified by immunofluorescence and immunocoprecipitation.Results Based on SPR technology， 172 proteins that may interact with Neuritin were screened， and ANXA2 was identified as the candidate protein for interaction with Neuritin by mass spectrometry and bioinformatics analysis. ANXA2 was verified by immunofluorescence and immunocoprecipitation.Conclusion Based on SPR technology， 172 proteins that may interact with Neuritin were screened， and ANXA2 was identified as the candidate protein for interaction with Neuritin by mass spectrometry and bioinformatics analysis. ANXA2 was verified by immunofluorescence and immunocoprecipitation. Neuritin interacted with ANXA2.

Key words： Neuritin;ANXA2;protein interaction;bioinformatics analysis;mass spectrometry

Neuritin （CPG15，NRN1，神经突起生长素）是神经发育和神经再生中发挥重要作用的神经营养因子，在中枢神经系统的发育过程中高度表达，能促进轴突和树突的生长［1］、神经元迁移以及突触的发育成熟［2-3］，调节突触环路的形成［4］，并可抑制神经元凋亡，维持神经元的存活［5］；中枢神经系统发育成熟后，其表达与损伤后的神经再生和修复、学习记忆密切相关［6-8］。我们的研究显示，Neuritin 重组蛋白［9］对损伤的大鼠坐骨神经和急性脊髓损伤有明显的修复作用［10-11］。然而，Neuritin 作用的分子机制有待深入，研究显示 Neuritin 可能通过 Notch 信号通路［12］、FGF 信号通路［13］、PI3K信号通路和胰岛素相关信号通路［14-16］等不同途径发挥作用。近来，Nedivi等研究显示，Neuritin通过与 AMPA 相互作用募集 PSD95 进而促进突触的稳定性［17］。Neuritin 作为一种孤配体，其发挥作用的受体尚不明确。寻找与其相互作用的蛋白对揭示其分子机制至关重要，对于诠释 Neuritin 在神经通路（信号途径）中的角色和作用，进一步发挥 Neuritin 在神经再生中的作用，具有重要的理论意义。

本研究中我们利用 SPR 技术联合质谱技术筛选捕获与 Neuritin 相互作用的差异蛋白，利用生物信息学对差异蛋白进行富集分析，最后通过免疫荧光及免疫共沉淀技术对候选蛋白进行验证，鉴定与 Neuritin 相互作用的蛋白，为探讨 Neuritin 发挥生物学作用的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

SH－SY5Y 细胞培养：在高糖DMEM培养基（BI，06-1055-57-1ACS）中定期培养，同时添加10%胎牛血清（BI，04-001-1A－US）、1%的三抗（BI，03-032-1B）。将细胞置于37℃、95%空气、5% CO2的湿化环境中培养至70%～80%融合，2～3 d传代1次。

PC12 细胞培养：在1640培养基（BI，06-1055-57-1ACS）中定期培养。同时添加5%胎牛血清（BI，04-001-1A－US）、10%马血清（Gibco，10099-141）、1%的三抗（BI，03-032-1B），马血清需提前56℃，30min灭活处理。将细胞置于37℃、95%空气、5% CO2的湿化环境中培养，2～3 d传代1次。

1.2 表面等离子共振传感 （Surface plasmon resonance，SPR） 技术筛选与 Neuritin 相互作用的蛋白质

准备 1mg 本实验室制备的 Neuritin 冻干粉 （纯度>90%），收集 2×107个状态良好的 PC12细胞。将备好的 Neuritin 蛋白干粉和 PC12 细胞送至广州高通生物技术有限公司，利用等离子表面共振（SPR）鉴定技术捕捉与 Neuritin 相互作用的蛋白质，并用质谱分析筛选出可能与 Neuritin相互作用的靶标蛋白。

1.3 生物信息学分析筛选出的差异蛋白

1.3.1 差异蛋白数据的获取

首先将与 Neuritin 相互作用蛋白的数据和对照组数据用 EXCEL 比对获得差异蛋白数据并去除无效数据。

1.3.2 GO分析

将上述获得的蛋白的 symbol 或 uniprot 登录号数据上传至 DAVID 数据库进行 GO 分析。注意选择对应的种属和上传数据的类型。以P<0.05为标准统计分析 GO 分析的结果并作图。

1.3.3 KEGG信号通路分析

将上述获得的蛋白的 symbol 或 uniprot 登录号数据上传至 DAVID 数据库，选择对应的种属和上传数据的类型进行 KEGG 信号通路分析。以P<0.05为标准统计分析 GO 分析的结果并作图。

1.4 甲醛交联法缩小差異蛋白的范围

（1）甲醛溶液的制备：PBS 溶解多聚甲醛使其浓度为1.6%。0.22 μm滤器过滤。

（2）交联，用1×PBS清洗处理过的细胞1～2次，加入1.6%的多聚甲醛室温温和震荡孵育7min。

（3）用1×PBS清洗处理过的细胞1～2次，洗去残余的多聚甲醛。加入总蛋白或膜蛋白裂解液提取细胞总蛋白或膜蛋白。Western Blot 鉴定 Neuritin 特异性条带的位置。

1.5 考马斯亮蓝染色

使用4%～20%浓度的 SDS－PAGE 凝胶（ACE，F15420Gel），160 V，45min条件下 SDS－PAGE 凝胶电泳，电泳结束后，将凝胶用考染液染色1 h，之后进行脱色处理，每隔10 min进行一次换液，直到目的条带清晰。

1.6 免疫荧光鉴定 Neuritin 与 ANXA2 在细胞膜上的共定位

（1）将细胞接种在盖玻片上并在 37℃下培养直到达到 50％～60％的密度。4％多聚甲醛固定细胞后山羊血清中封闭 30 min。

（2）37℃，2 h孵育Neuritin与ANXA2的一抗。用 1×PBS冲洗3次，每次3 min。

（3）孵育山羊抗小鼠 FITC 标记的 IgG 或罗丹明标记的山羊抗兔 IgG，条件为37℃，1 h。孵育完成后用步骤（4）中的方法冲洗波片。

（4）数码照片是用蔡司 LSM 510 Meta 激光扫描共聚焦显微镜或奥林巴斯 IX70 倒置显微镜拍摄的。最后用 Photoshop CS6 和 Illustrator CS6 对图像进行处理。

1.7 免疫共沉淀鉴定 Neuritin 与 ANXA2 的相互作用

1.7.1 按照实验需求及产品说明书预处理

A/G protein 悬珠（GE Healthcare，17-6002-35）。

1.7.2 蛋白样品与一抗的孵育

将提取的总蛋白或膜蛋白分为实验组和对照组，向对应的 EP 管中加入推荐稀释比例的一抗（Neuritin 1∶500），4 ℃旋转过夜，混合物取出后，转移至装有适量 Protein garose 的 EP 管中，4 ℃ 温和旋转孵育 4～6 h。

1.7.3 目的蛋白的获取

取出装有蛋白-抗体-A/G beads 的混合液，吸取上清变性后储存-20 ℃备用。

向沉淀的中加入 1 mL 预冷的全细胞裂解液（no SDS） 4 ℃旋转孵育 10 min。重复该步骤3次。4 ℃离心30 s，14 000 r·min-1，加入 1 mL 预冷的全细胞裂解液（with SDS），4 ℃温和旋转孵育 5 min。重复该步骤两次，弃上清。将沉淀变性后得到混合蛋白。

1.7.4 Western Blot

使用4%～20%浓度的 SDS－PAGE 凝胶（ACE，F15420Gel），160 V 45min条件下 SDS－PAGE 凝胶电泳，然后按15 V，33 min（Tanon，VE-386CE）条件使用半干转方法将蛋白转移到PVDF膜（Immobilon，ISEQ00010）上，使用5%脱脂奶粉将PVDF膜封闭2h，然后使用5%脱脂奶粉按1∶1 000比例稀释Neuritin抗体（Abcam，64186），4°过夜，第二天按1∶5 000比例稀释山羊抗免二抗（中杉金桥），常温孵育2h，洗膜后使用增强的化学发光系统（BIO－RAD，1705060）可视化免疫反应带。

2 结果

2.1 Neuritin 蛋白在 SH－SY5Y 细胞中的定位及表达

筛选与 Neuritin 相互作用的蛋白，首先要明确 Neuritin 蛋白在细胞上的定位。我们利用免疫荧光技术检测Neuritin在细胞上的定位情况。结果显示 Neuritin 蛋白（红色）主要分布在 SH－SY5Y 细胞膜的周边和突起（图1A），并且与脂筏标记物 Caveolin1（绿）和 Flotillin1 （绿） 在 SH－SY5Y 细胞膜上共定位（黄）。同时，利用 Western－blot 技术检测 Neuritin 蛋白及脂筏标志物在 SH－SY5Y 细胞中的表达情况，结果显示：Neuritin、Caveolin1 和 Flotillin1 蛋白均表达（图1B）。以上结果证实 Neuritin 蛋白定位在SH－SY5Y细胞膜上。

2.2 SPR 技术筛选与 Neuritin 相互作用的蛋白

SPR 技术筛选与 Neuritin 相互作用的蛋白结果如下，见表1。

我们利用SPR技术筛选与Neuritin相互作用的蛋白，首先将 Neuritin 蛋白固定于芯片的金属膜表面，实时监控芯片表面折射率的变化，来反应 Neuritin 蛋白与 PC12 细胞裂解液中靶标蛋白结合过程，然后将 Neuritin 捕捉到的蛋白酶解成肽段混合物，利用 LC－MS/MS 分析鉴定，获得 172 条可能与 Neuritin 相互作用的靶标蛋白，内容详见表1。

2.3 生物信息学进行富集分析

为缩小验证靶标蛋白质的范围，我们采用生物信息学对以上172条蛋白质进行富集分析，细胞组分富集分析结果显示：位于细胞膜上的蛋白共 59条。生物过程富集分析结果显示：该部分数据富集的生物过程包括：GTP 结合分子、mRNA剪切体的正向调控等。

功能富集分析结果显示：该部分数据富集的分子功能包括：突触可塑性、细胞迁移、微管蛋白结合等（图2A）。KEGG 信号通路富集分析结果显示，此部分数据与内吞作用、上皮细胞的细菌侵入途径、肌动蛋白细胞骨架调节、蛋白多糖与癌症等多种信号通路相关（图2B）。

2.4 甲醛交联法捕捉与 Neuritin 相互作用的蛋白

为了进一步缩小验证范围，本研究采用甲醛交聯的方法对 Neuritin 及其互作蛋白之间的相互作用进行固定，膜蛋白WB结果显示，原本位于15 kd 的全长Neuritin蛋白条带消失，但在 35 kd 左右出现较浓的条带（图3A），且实验组比对照组条带加深（图3B），提示 Neuritin 及其相互作用的蛋白结合在一起使Neuritin条带的分子量比预期增大，因此本研究将考染胶同样位置的条带切下做蛋白质质谱检测（图3B），对质谱原始数据采用 Pfind 指定Neuritin进行搜库，找到了Neuritin特异性序列（图3C），Blast结果显示，该肽段只能代表Neuritin。其余质谱结果见表2，其中ANXA2的肽段丰度最高，且在SPR结果中也出现了该蛋白，提示Neuritin与ANXA2可能存在特异性相互作用，值得进一步实验验证。

2.5 Neuritin 与 ANXA2 相互作用鉴定

为了验证 Neuritin 与 ANXA2 是否存在天然的相互作用，本研究采用免疫共沉淀对二者在SH－SY5Y细胞中的相互作用进行验证。首先免疫荧光共定位结果显示，在 SH－SY5Y 细胞中二者均有表达且存在共定位，且定位发生在胞膜上（图4A）。免疫共沉淀结果显示，采用Neuritin抗体，以细胞内原性Neuritin蛋白为诱饵蛋白进行免疫共沉淀时，ANXA2出现特异性条带 （图4B）。提示Neuritin与ANXA2存在天然的相互作用。

3 讨论

Neuritin通过促进神经突生长和突触成熟在神经发育和再生中起着关键作用［18］，但介导其发挥作用的受体至今还未有文献报道。本研究旨在利用多种方法寻找并鉴定与 Neuritin 相互作用的蛋白质。

首先我們明确了 Neuritin 在 SH－SY5Y 细胞膜上的定位与表达，且与脂筏共定位。据此推断，Neuritin 可能也依赖于细胞膜受体发挥其促进突起生长，保持神经元存活的功能。本研究在细胞分子水平，采用了 SPR、甲醛交联法以及生物信息学等多种技术手段，对 Neuritin 相互作用的蛋白进行了筛选与鉴定。

PC12细胞作为我们课题组前期建立的功能评价平台，是观察Neuritin蛋白对促进细胞突起生长作用的良好模型。本研究以His－Neuritin 重组蛋白作为诱饵蛋白，用 PC12 细胞裂解液作为猎物蛋白进行垂钓，蛋白质质谱共鉴定出有效蛋白 172 个。之后通过 GO 分析对该数据的细胞组分进行筛选，共筛选出细胞膜蛋白共 59 个，这些蛋白均有可能成为 Neuritin 在细胞膜上发挥作用的受体蛋白。之后，为了更加准确的对 Neuritin 调控或者被调控的机制进行预测，本研究对这些蛋白的生物过程、分子功能以及信号通路进行富集分析。结果显示有多种生物进程和信号通路可能与 Neuritin 存在直接或间接相关性，该结果提示 Neuritin 在生物体内有复杂的调控网络，参与多种生物过程。

为了进一步缩小 Neuritin 作用靶点的验证范围，本研究采用了甲醛交联法对 SH－SY5Y 细胞中的蛋白质相互作用进行固定［18］，WB 鉴定 Neuritin 特异性条带的位置。结合灰度扫描和蛋白质质谱的结果，本研究发现 Neuritin 与某靶标蛋白结合而使其电泳后在35kD处。在对这个条带的鉴定中鉴定出了十几种蛋白质，其中包括了肽段丰度最高且与 SPR 膜蛋白筛选结果重合的蛋白质 ANXA2。

ANXA2 是一种钙依赖性蛋白，在调节细胞功能上扮演多个角色，包括血管生成、增殖、凋亡、细胞迁移、入侵和粘附、突起生长等［19］，这些功能与 Neuritin 的功能比较相似。我们通过免疫荧光及免疫共沉淀鉴定了 Neuritin 与 ANXA2 的共定位及相互作用，提示 ANXA2 与 Neuritin 之间存在相互作用，但免疫沉淀中 ANXA2 与 Neuritin 的条带都比较浅，可能由于抗体亲和力较差，或二者的亲和力较弱，还需更多的实验进一步验证二者的结合关系。本研究为寻找 Neuritin 的受体蛋白以及探讨 Neuritin 发挥生物学作用的分子机制提供了线索与理论基础。

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（責任编辑：编辑唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2023-02-16

基金项目：国家自然科学基金项目（32060164）

作者简介：朱金辉（1998—），男，硕士研究生，专业方向为蛋白质功能与疾病。

*通信作者：黄瑾（1963—），女，教授，从事蛋白质功能与疾病方面的研究，e－mail：huangjin623@163.com。