以啤酒废麦糟为原料发酵制备银耳多糖的研究*

康赛男，李勇康，高梦雅，梅 龙，王学慧，张凤琴

(巢湖学院化学与材料工程学院，安徽 巢湖 238000)

麦糟又叫啤酒糟，是啤酒酿造过程中产生的最主要的副产物，含有丰富的非淀粉多糖(纤维素、半纤维素)、木质素、蛋白质等[1]。目前对麦糟的利用主要是作为动物饲料[2]。随着全球啤酒产量逐年增长，多余的麦糟一般作为固体废物直接排放，既浪费资源又污染环境。随着人类环保意识的增强，对麦糟的开发利用成为研究热点[3]。

银耳多糖是一种酸性杂多糖，银耳多糖在药理作用上表现为担子菌多糖类免疫增强剂，具有改善机体免疫功能及提升白细胞的作用[4-5]。目前银耳多糖主要从银耳子实体中提取得到[6]，但由于银耳子实体生长周期长，受环境、气候等条件的影响[7]，故无法获得大量银耳多糖，采用啤酒废麦糟培养银耳菌的发酵方法来获得银耳多糖，发酵周期短，且生产过程不受自然环境影响，能较大地提高生产银耳多糖的效率。

本研究通过利用麦糟中的残余营养物质发酵培养银耳菌以制备银耳多糖，使其最大限度地被利用，达到了变废为宝的效果，响应了我国可持续发展的号召，符合绿色的新发展理念。

1 材 料

1.1 菌 种

银耳菌种，购自CICC，4 ℃冰箱保藏。

1.2 试 剂

葡萄糖，蔗糖，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，硫酸镁，蒽酮，硫酸，均为分析纯；维生素B1，PDA培养基，尿素，酵母浸膏，均为生物试剂；啤酒废麦糟，取自实验室。

1.3 仪 器

ZHP-Y2102L智能恒温振荡培养箱，SW-CJ-2F洁净工作台，SHP-160D智能低温生化培养箱，LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器，HC-2514高速离心机，DHG-9101-OS 电热恒温鼓风干燥箱，SH2-82数显气浴恒温振荡器，HH-W600数显三用恒温水箱，TU-1810紫外可见分光光度计。

2 实验方法与结果分析

2.1 实验流程

以啤酒废麦糟为原料发酵生产银耳多糖的流程如图1所示。

图1 以啤酒废麦糟为原料发酵生产银耳多糖的流程图

2.2 以麦糟为原料的发酵培养基

葡萄糖35 g，蔗糖17.5 g，磷酸二氢钾0.5 g，酵母浸膏3 g，尿素1.5 g，粉碎的干麦糟若干，加入纯水搅拌溶解，定容至1000 mL，调节pH。115 ℃灭菌30 min。

2.3 多糖的测定

测定多糖的含量[8]，以葡萄糖为标准品，采用蒽酮比色法在620 nm处比色，记录OD值，绘制标准曲线。将上述多糖提取液定容至100 mL，取各样品1 mL于试管中，再加入蒽酮―硫酸试剂5 mL，摇匀，沸水浴10 min，取出冷却后于620 nm下比色，记录OD值，根据公式计算多糖含量。

银耳多糖含量=总糖含量-还原糖含量

式中：c为根据OD值从标准曲线上查得样品测定管中多糖质量浓度，mg/mL；V为样品提取时定容体积，mL；m为样品质量，g。

3 结果与讨论

3.1 麦糟浓度的优化

碳源是微生物细胞生命活动所需能量的来源，为微生物的正常生长，分裂提供物质基础，氮是构成重要生命物质蛋白质和核酸等的重要元素。废麦糟中含有丰富的非淀粉多糖(如纤维素)作为碳源和蛋白质作为氮源，可以为银耳多糖的制备提供原料。

分别配制 3.3 g/L，6.6 g/L，10.0 g/L，13.3 g/L，16.6 g/L麦糟的发酵培养基，初始pH为7.0，按5%的接种量接种银耳菌株于培养基中。置于25 ℃，120 r/min的条件下发酵3天，测定银耳菌胞内和胞外银耳多糖含量。

不同麦糟浓度测得银耳多糖浓度如图2所示。

图2 麦糟浓度的优化

由图2可以看出，麦糟浓度低于6.6 g/L时，银耳多糖浓度呈上升趋势，麦糟浓度高于6.6 g/L时，银耳多糖浓度开始下降。麦糟浓度为6.6 g/L时银耳多糖浓度最高，此条件下胞内银耳多糖浓度为0.065 mg/mL，胞外银耳多糖浓度为0.124 mg/mL，总银耳多糖浓度为0.189 mg/mL。

3.2 发酵pH的优化

pH对微生物的生命活动有很大的影响[9]，它通过使蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷发生变化，从而影响其生物活性；同时会引起细胞膜电荷变化，导致微生物细胞吸收营养物质能力改变。

配制10.0 g/L麦糟的发酵培养基，调节培养基的初始pH分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，按5%的接种量接种银耳菌株于培养基中，置于25 ℃，120 r/min的条件下发酵3天，测定银耳菌胞内和胞外银耳多糖含量。

不同pH测得银耳多糖浓度如图3所示。

图3 发酵pH的优化

由图3可以看出，pH<7.0时，银耳多糖浓度呈上升趋势，pH>7.0时，银耳多糖浓度略有下降。pH=4时银耳多糖浓度最低，可能是由于在过酸的条件下，银耳菌的生长受到了抑制，使得银耳多糖产量变低。pH=7.0时得到的银耳多糖浓度最高，此条件下胞内银耳多糖浓度为0.059 mg/mL，胞外银耳多糖浓度为0.149 mg/mL，总银耳多糖浓度为0.198 mg/mL。

3.3 发酵转速的优化

在摇床发酵过程中，发酵液随着摇床的振荡而增加了溶氧量，这样既有利于菌株的生长繁殖也促进了银耳多糖的产生。

配制麦糟含量为10.0 g/L的发酵培养基，初始pH为7.0，按5%的接种量接种银耳菌株于培养基中，置于温度为25 ℃、转速分别为90 r/min，105 r/min，120 r/min，135 r/min，150 r/min的条件下，发酵3天，测定银耳菌胞内和胞外银耳多糖含量。

不同转速测得银耳多糖浓度如图4所示。

由图4可以看出，转速低于105 r/min时，银耳多糖浓度呈上升趋势，可能是由于转速增大使溶氧量增加，从而促进了于银耳菌的生长，导致银耳多糖浓度升高；转速大于105 r/min时，银耳多糖浓度呈下降趋势，可能是因为转速过大，发酵液旋转时的剪切力变大，使大部分菌丝体发生断裂，影响了菌丝体的正常生长。转速过高，容易出现发酵液飞溅，打湿封口棉塞引起染菌。转速为105 r/min时得到的银耳多糖浓度最高，此条件下胞内银耳多糖浓度为0.054 mg/mL，胞外银耳多糖浓度为0.145 mg/mL，总银耳多糖浓度为0.199 mg/mL。

3.4 发酵周期的优化

配制麦糟含量为10.0 g/L的发酵培养基，初始pH为7.0，按5%的接种量接种银耳菌株于培养基中。置于25 ℃，120 r/min的条件下分别发酵1天、2天、3天、4天、5天，测定银耳菌胞内和胞外银耳多糖含量。

不同发酵周期测得银耳多糖浓度如图5所示。

图5 发酵周期的优化

由图5可以看出，银耳多糖浓度随着发酵周期的增多而上升，发酵周期在第5天得到的银耳多糖浓度最高。可能是发酵周期增多，生物量增加，从而使银耳多糖浓度上升。此条件下胞内银耳多糖浓度为0.073 mg/mL，胞外银耳多糖浓度为0.109 mg/mL，总银耳多糖浓度为0.182 mg/mL。

本研究对发酵周期的优化尚存在不足。郭燕娇[10]、何钢[11]通过对银耳多糖发酵产胞外多糖周期的确定发现，以葡萄糖和蔗糖为碳源的情况下，在发酵前期，银耳多糖的浓度随着发酵周期的增加而升高，在第6天时达到了最大值，随后开始出现下降。杨彬[12]发现，发酵周期过长，银耳菌丝体大量生长，包裹在发酵液表面，导致供氧不足。而菌丝体的生长需要消耗大量氧气，在供氧不足的情况下，菌丝体进行无氧呼吸，使银耳多糖浓度下降。

采用优化后最佳发酵条件进行培养：麦糟浓度6.6 g/L，初始pH 7.0，摇床转速为105 r/min，发酵周期5天。此条件下得到的胞内银耳多糖浓度为0.083 mg/mL，胞外银耳多糖浓度为0.143 mg/mL，总银耳多糖浓度为0.236 mg/mL。

4 结 论

经过对以啤酒废麦糟为原料发酵制备银耳多糖条件的研究，得出发酵的适宜条件为：麦糟浓度为6.6 g/L，初始pH为7.0，发酵转速为105 r/min，发酵周期为5天。此条件下发酵得到的胞内银耳多糖浓度为0.083 mg/mL，胞外银耳多糖浓度为0.153 mg/mL，总银耳多糖浓度为0.236 mg/mL，提取率为45.19%，提取率较优化前提高了18.59%。本研究对啤酒废麦糟进行再利用，最大化的发挥了废麦糟的利用价值，达到了变废为宝的效果，响应了我国可持续发展的号召，符合绿色的新发展理念。