临床常用抗菌药物组合对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的体外抗菌作用

王元春,张丽华,吴庆荣,杨建林,卓倩

作者单位： 341000 江西省赣州市第五人民医院

碳青霉烯类抗菌药物属于目前临床应用最广且抗菌活性最强的β-内酰胺类抗菌药物,对肺炎克雷伯菌具有较好的抗菌活性[1],至今仍是临床治疗肺炎克雷伯菌感染的首要抗菌药物。近年来,碳青霉烯类抗生素临床应用频率日益增加,逐渐出现耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)[2],全球各国存在蔓延形势,美国、希腊、意大利等地也相继出现CRKP流行的报道[3]。欧洲抗菌素药性监测网络报道意大利CRKP检出率由2006—2009年的1%～2%上升到2011年的30%[4]。另外,国内CRKP数量也逐年增加,2017年肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为20.9%、24.0%[5]。另外,中国细菌耐药监测网数据显示,在我国临床标本分离的细菌中,2021年肺炎克雷伯菌在临床分离菌株主要菌群分布中排名第二[6],然而CRKP是流行性碳青霉烯耐药肠杆科细菌(CRE)感染中最重要的病原体,病死率高达18%～60%[7-8]。当前形式严峻,已成为临床治疗感染的难题之一。因此,CRKP对常见抗菌药物易产生多重或广泛耐药,使得临床医师选择抗菌药物的种类有限,单一用药治疗效果甚微,临床常采用联合用药治疗方案。本研究旨在评价多黏菌素B、亚胺培南、米诺环素、替加环素、多西环素联合用药方案治疗CRKP感染的体外活性和可行性,以期为有效治疗CRKP感染提供理论依据,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 选取2018年6月—2019年10月赣州市第五人民医院临床分离的7株非重复CRKP菌株,来源于痰液4株、尿液2株、血液1株。

1.2 仪器与试剂 WalkAway-96 plus细菌鉴定及药敏分析系统(德国西门子);Gel DOCTMXR+凝胶成像系统(美国伯乐);DYY-6C型琼脂糖水平电泳仪;BIO-RAD基因扩增仪(美国伯乐);96孔平底培养板(无锡耐思生物科技有限公司生产);核酸染料(北京天根生化科技有限公司生产);琼脂糖(西班牙Biowest生产);Muller-Hinton(MH)琼脂培养基(美国Difco公司生产);Muller-Hinton(MH)肉汤(美国Difco公司生产);质控菌株为大肠杆菌ATCC25922(购自中国药品生物制品检验所);亚胺培南(大连美仑生物技术有限公司生产);替加环素、氨曲南、庆大霉素、米诺环素、多西环素(均由阿拉丁生物试剂公司生产)。

1.3 方法

1.3.1 CRKP菌株确定:使用WalkAway-96 plus细菌鉴定及药敏分析系统对菌株进行筛选,选出对美罗培南或亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌株,并采用微量肉汤稀释法进一步验证药敏结果。CRKP即肺炎克雷伯菌至少对1种碳青霉烯类药物美罗培南或亚胺培南耐药[最低抑菌浓度(MIC)≥2 mg/L]。

1.3.2 CRKP基因组DNA模板提取:采用热激法制备CRKP的DNA模板,用无菌棉签将分离纯化的细菌洗脱到200 μl无菌蒸馏水中,并置于-20 ℃冰箱中,1 min后取出,放入预先备好的100 ℃金属水浴锅中静置10 min,然后置于-20 ℃中保持1 min,后以10 000 r/min离心10 min使被裂解的细菌沉淀下来,将上清液吸取到新的EP管中,该上清液即为提取的CRKP基因组DNA模板溶液,将样品储存在-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3.3 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)基因的扩增:使用PCR技术同时扩增肺炎克雷伯菌的5种碳青霉烯酶基因KPC、IMP、OXA、VIM、NDM并鉴定,引物序列见表1。

表1 KPC基因引物序列及预计片段

1.3.4 KPC基因扩增片段电泳鉴定:用980 ml的去离子水与20 ml的50×TAE原液混合,稀释至1*TAE缓冲液,以配置2%琼脂糖凝胶和电泳液。反应结束后,按顺序在泳道内分别加入10 μl PCR产物,电压设置为100 V,由负极向正极电泳30 min。电泳结束后,将凝胶放置在紫外光线下,用Gel DOCTMXR+凝胶成像系统观察结果并拍照保存。最后,将相关片段送至广州擎科生物技术有限公司测序。

1.3.5 联合药敏试验:采用96孔板棋盘法:在96孔平底培养板上加入50 μl不同浓度的A药和B药,并在第一行中仅加入100 μl的A药,第一列仅加入100 μl的B药,药物浓度由低至高,再将浓度为1×106CFU/ml的肺炎克雷伯菌菌液100 μl加入96孔平底培养板的1～11列中,使菌液终浓度约为5×105CFU/ml。设定生长对照(只加细菌,无药物)和无菌对照[只加Muller-Hinton(MH)肉汤,无细菌]。将96孔平底培养板放置在旋涡混合仪上混合20 s,并置入37 ℃培养箱中,20 h后观察结果。记录96孔平底培养板中两药联合区域最佳组合效应时各自的MICA联合和MICB联合,计算联合抑菌指数(FICI),两药作用判定标准见表2。

表2 两药作用判定标准

2 结 果

表3 CRKP菌株药敏结果

2.2 CRKP耐药基因检测结果 PCR技术扩增及琼脂糖凝胶电泳结果表明,这些菌株均为产KPC(引物序列片段246 bp)的肺炎克雷伯菌,经测序后证实为KPC基因,见图1。

图1 部分琼脂糖凝胶电泳结果

2.3 抗菌药物联合应用对CRKP的体外抗菌作用 多黏菌素B与亚胺培南联合应用以相加作用为主,其中相加作用率为57.14%(4/7),无关作用率为42.86%(3/7)。多黏菌素B与替加环素联合应用时以相加作用为主,其中相加作用率为71.43%(5/7),协同作用率和无关作用率均为14.29%(1/7)。多黏菌素B与米诺环素联合应用也以相加作用为主,其中相加作用率为85.71%(6/7),无关作用率为14.29%(1/7)。多黏菌素B与多西环素联合应用也以相加作用为主,其中相加作用率为57.14%(4/7),无关作用率为14.29%(1/7),拮抗作用率为28.56%(2/7)。

替加环素与亚胺培南联合应用则以拮抗作用为主,其中拮抗作用率为71.43%(5/7),相加作用率和无关作用率均为14.29%(1/7)。米诺环素与亚胺培南联合应用以无关作用为主,其中无关作用率为71.43%(5/7),协同作用率和拮抗作用率均为14.29%(1/7)。多西环素与亚胺培南联合应用以拮抗作用为主,其中拮抗作用率为85.71%(6/7),相加作用率为14.29%(1/7),见表4。

表4 抗菌药物联合应用对CRKP的体外抗菌作用 (株)

3 讨 论

肺炎克雷伯菌隶属肠杆菌科中重要的致病菌,可引起社区及医院获得性感染,导致肺炎、肝脓肿、泌尿系统感染及血流感染等多种感染性疾病[7]。随着近年来广谱抗生素药物的广泛应用或滥用,耐多药菌越来越多,给临床治疗带来极大挑战[9],抗菌药物品种选择有限,特别是耐药肺炎克雷伯菌,已成为目前广泛关注的高耐药性致病菌[10]。碳青霉烯类药物被认为是治疗产超广谱β-内酰胺酶细菌的首选抗生素[11],但临床频繁使用导致并加剧了碳青霉烯类耐药菌株出现。据文献报道,替加环素、黏菌素、磷霉素及其他早期使用的药物对碳青霉烯耐药菌株具有抗菌活性[12],然单一用药也可使病原菌耐药性增加[13],这无疑给临床治疗CRKP带来巨大挑战。有研究表明,联合用药在降低院病死率、细菌清除失败率和提高14 d累积生存率方面均优于单药治疗[14]。因此,临床医师更倾向于选择联合用药治疗多重耐药菌感染性疾病。但目前不同药物组合的抗菌活性并不确切。因此,本研究通过实验评价临床上几种常见抗菌药物组合对CRKP的体外抗菌活性。

本研究将选取的菌株经临床实验均证实为产KPC的CRKP,这与研究报道的中国CRKP最常见的产碳青霉烯酶是KPC相符合,同时也表明医院CRKP的最主要机制为产KPC,临床对此应给予重点关注。药敏试验结果显示,多黏菌素B与亚胺培南联合应用以相加作用为主,其中相加作用率为57.14%,无关作用率为42.86%。国外一项回顾性研究表明,多黏菌素B与碳青霉烯药物联合治疗CRKP的协同作用率高达44%[15],本研究结果与之接近。此外,多黏菌素B与替加环素联合应用时以相加作用为主,其中相加作用率为71.43%,协同作用率和无关作用率均为14.29%,与Ku等[16]研究结果一致。多黏菌素B与米诺环素联合应用也以相加作用为主,其中相加作用率为85.71%,无关作用率为14.29%,进一步验证了Huang等[17]报道的多黏菌素与米诺环素联合应用具有协同作用。替加环素与亚胺培南联合应用则以拮抗作用为主,其中拮抗作用率为71.43%,相加作用率和无关作用率均为14.29%。有报道显示,替加环素联合亚胺培南有一定的协同杀菌效应,但这种联合治疗方案的临床疗效并不理想[18-19]。但临床上存在替加环素联合碳青霉烯类药物成功治疗CRKP感染的病例,可能是替加环素起到主要抗菌活性作用,碳青霉烯类药物的协同作用仍不清楚。因此,应根据药敏试验结果选择治疗CRKP感染的具体方案。米诺环素和亚胺培南联合应用以无关作用为主,其中无关作用率为71.43%,协同作用率和拮抗作用率均为14.29%;多黏菌素B与多西环素联合应用也以相加作用为主,其中相加作用率为57.14%,无关作用率为14.29%,拮抗作用率为28.56%,表明以多黏菌素B为基础的联合用药(联合亚胺培南/替加环素/米诺环素/多西环素)对CRKP具有较好的抗菌活性,而亚胺培南联合米诺环素/多西环素/替加环素的抗菌活性未改变或降低。

综上所述,以多黏菌素B为基础的联合用药是治疗CRKP感染的有效措施,同时也提示临床在选择替加环素、多西环素、米诺环素治疗CRKP感染时,尽量避免与碳青霉烯类药物联合使用,以免降低药物疗效。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。