PCR 法快速鉴定小儿咳喘灵颗粒中大肠埃希菌*

金昊嵩，赵中开，胡 凤，韩志双

（四川省自贡检验检测院，四川自贡 643000）

小儿咳喘灵颗粒常用于治疗儿童哮喘、支气管肺炎等疾病［1］，属《中国药典》规定的非无菌不含药材原粉的中药口服固体制剂。依据2020 年版《中国药典（四部）》微生物限度规定，大肠埃希菌属该品种项下最基本的微生物控制菌检测项目。大肠埃希菌为革兰阴性兼性厌氧杆菌，是人和动物肠道中的正常栖居菌，同时也是一种条件致病菌，其某些血清型能产生肠毒素，具有致病性。该菌在临床的感染率和耐药性均较高，已成为威胁患者健康的常见病原菌［2］。2015及2020年版《中国药典》均提到，分离纯化可疑菌后应使用适宜的鉴定试验确证是否为大肠埃希菌，但未具体规定选用何种鉴定方法。大肠埃希菌属常规鉴定主要采用生化反应法，如4-甲基伞形酮葡糖酸酐（MUG）试验、靛基质（吲哚）试验和IMViC 试验［3］［为靛基质（I）试验、甲基红（MR）试验、乙酰甲基甲醇生成（VP）试验、枸橼酸盐利用（C）试验等的合称］。本研究中拟采用聚合酶链反应（PCR）法，优先选择大肠埃希菌的特征基因uidA 进行检测。该基因参与编码β-D-葡糖醛酸酶，有相对特异性，已用于检测大肠埃希菌的众多表型和分子分析［4-5］，但查阅文献［6］和试验结果发现，部分志贺菌属的uidA 基因检测结果也可能为阳性。侵袭性质粒抗原H 基因（ipaH 基因）为负责上皮细胞渗透和细胞间传播的关键，在志贺菌的染色体和质粒上存在多个拷贝［7］。目前已将该基因作为检测靶点运用于志贺菌的快速检测［8］。但其也是肠道侵袭性大肠埃希菌（EIEC）的特征基因，该基因检测无法准确区分志贺菌和EIEC［9］。故又加入侵袭性质粒调节基因（invE），该基因在EIEC 检验中与ipaH 基因等效［10］，可作为EIEC 特征基因进行检测。根据3 种基因检测结果共同判定，为菌属的快速鉴定提供参考。现报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LightCycler96 型PCR 仪（瑞士Roche 公司）；EPS -600 型电泳仪、Tanon - 3500 型数码凝胶图像分析系统（上海天能科技有限公司）。

1.2 材料

药品：选用小儿咳喘灵颗粒［11］（相关信息见表1）。

表1 药品相关信息Tab.1 Relevant information of drugs

试剂：Premix Ex Taq HS预混液（宝日医生物技术有限公司，批号为AKG2211A）、10×Loading Buffer、Marker DL500（宝日医生物技术有限公司，批号为AJE1680A）；琼脂糖、50 × TAE 缓冲液、Marker DL2000（生工生物工程股份有限公司，批号分别为H902BA0030，G612KA5970，G701KA6075）；4S GelRed 核酸染料（BBI生命科学有限公司，批号为H809KA1140）；胰酪大豆胨液体培养基（TSB，批号为1114012）、肉桂基硫酸盐胰蛋白胨（MUG）肉汤培养基（LST - MUG，批号为1094511）、脑心浸出液肉汤（BHI，批号为1101561），均购自广东环凯微生物科技有限公司；大肠杆菌IMViC生化鉴定管（青岛海博生物技术有限公司，批号为20220225）；水为无菌水。

菌株：22种（24株）试验菌株相关信息见表2。其中，b，m 菌株来源于中国食品药品检定研究院（m 菌株为其行沙门能力验证样品分离获得）；o-s，u，x菌株来源于为中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）；其余菌株均来源于广东环凯生物科技有限公司。ETEC 为产肠毒素大肠埃希菌；EHEC 为肠道出血性大肠埃希菌；EIEC 为肠道侵袭性大肠埃希菌；EPEC 为肠道致病性大肠埃希菌；EAEC 为肠道集聚性大肠埃希菌。志贺菌属根据其生化和血清学特征分为痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内氏志贺菌。

表2 试验菌株Tab.2 Test bacterial strains

引物：参考文献［10］，确定uidA，ipaH，invE 基因的引物序列，委托宝日医生物技术有限公司合成，用Tris-EDTA（TE）缓冲液稀释至工作浓度（分别为5，5，2.5 μmol/L）。引物序列信息见表3。

表3 引物序列Tab.3 Primer sequences

2 方法与结果

2.1 PCR 试验

2.1.1 方法

供试液制备：取菌株样品各适量，分别接种至BHI培养基，36 ℃培养24 h得增菌液，用生理盐水稀释成含菌量约100 cfu/mL 的菌悬液。称取样品10 g，置100 mL TSB 中充分溶解，制成1∶10（m/V）的供试品溶液，再分别加入菌悬液1 mL，36 ℃培养24 h。

DNA 提取：取培养后的TSB 培养基增菌液1 mL，15 000 r/min离心5 min，弃上清液；加入1 mL无菌水振荡悬浮沉淀，15 000 r/ min 离心5 min，弃上清液；再向沉淀中加入500 μL 无菌水，振荡使其充分悬浮；100 ℃水浴加热15 min，12 000 r/ min 离心5 min，取上清液，即得DNA模板溶液。

PCR 反应体系配制：反应总体积25 μL，分别加入Premix Ex Taq HS 预混液12.5 μL，上下游引物各1 μL，无菌水8.5 μL，DNA模板2 μL。

PCR扩增条件：预变性95 ℃5 min；变性95 ℃30 s，退火63 ℃30 s，延伸72 ℃90 s，循环30次；延伸72 ℃5 min。

电泳：用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，电压5 V/cm，时间45 min。以凝胶成像结果条带位于1 000～2 000，500～750，750 bp分别为uidA，ipaH，invE基因阳性。

2.1.2 结果

大肠埃希菌和主要致病菌uidA基因检测结果见图1。其中marker1 为marker DL500，marker2 为marker DL2000。uidA 基因PCR 检测可区分大肠埃希菌与大部分常见致病菌，但无法区分某些志贺菌（如宋内氏志贺菌）与大肠埃希菌。志贺菌与大肠埃希菌在基因层面上同源性较高［12］，在NBCI 的GenBank 中搜索发现，宋内氏志贺菌、鲍氏志贺菌的染色体上也存在uidA 基因序列（如CP064376.1，1428190 - 1429696，CP068090.1，103038-104513）。为有效区分志贺菌和大肠埃希菌，本研究中先后加入了志贺菌属的特征基因ipaH和invE基因。

图1 大肠埃希菌和主要致病菌uidA基因检测结果Fig.1 Results of uidA gene testing of Escherichia coli and major pathogenic bacteria

3 种基因检测结果见图2、图3 及表4。图2 中，条带1-7 为ipaH 基因，8-14 为invE 基因；每组从左至右依次为a，s，r，p，o，q，t；条带15 为marker DL2000。图3 中，条带1-8 为ipaH 基因，10-17 为invE 基因，18-25 为uidA 基因；每组从左到右依次为空白，x，w，v，u，q，p，b；条带9为DL2000。

图2 大肠埃希菌与福氏志贺菌的2种基因检测结果Fig.2 Results of two gene testing of Escherichia coli and Shigella flexneri

图3 大肠埃希氏菌与志贺菌的3种基因检测结果Fig.3 Results of three gene testing of Escherichia coli and Shigella species

表4 3种基因的检测及判定结果Tab.4 Results of testing and identification of three genes

由表4 可知，大肠埃希菌和志贺菌均约有2 种结果组合，其中前者除EIEC 外，其余结果均一致；且2 种菌的结果组合均无重叠，故能通过本方法区分［13］。但本试验结果显示，EIEC除能检出ipaH基因外，还能检出invE基因，而4 种志贺菌均不能检出invE 基因，因此invE 基因可进一步区分EIEC和志贺菌属，得以下判定规则。当结果为uidA 基因阴性时可判定为大肠埃希菌未检出（但uidA，ipaH，invE 基因结果为+ - - 时可判定为大肠埃希菌，为+ + +时可判定为EIEC，其余结果则为非大肠埃希菌。

2.2 生化试验

方法：将2.1.1 项下供试液分别划线接种于LST -MUG 中，36 ℃培养24 h；同时取2.1.1 项下供试液分别进行IMViC 试验：I试验36 ℃下培养24 h，MR试验36 ℃下培养96 h，VP试验36 ℃下培养48 h，C试验36 ℃下培养24 h。取培养后的LST - MUG 置366 nm 波长紫外光下观察；将培养后的IMViC 试管分别滴加I 试剂、MR -VP试剂，并观察。

结果：结果见表4（IMViC 项结果分别采自I，MR，VP，C试验）。

3 讨论

3.1 特异（专属）性

本研究中选择PCR 方法的目的为检测目标基因的特异性，故选择的22 种（24 株）病原微生物均为食品药品检验实验室常见品种。本研究结果显示，uidA 基因在大部分情况下具备大肠埃希菌检测的特异性，但志贺菌和EIEC 的特殊性使ipaH 和invE 基因的加入成为必要，运用3 种基因组合判断，只需1 次PCR 检测即可判定大肠埃希菌；而在生化试验中，MUG 试验的产气肠杆菌和大肠埃希菌同为产气荧光，弗氏柠檬酸杆菌和EHEC 同为产气无荧光，证明单用该方法无法准确区分产气肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌，且EHEC可能存在漏检。少部分非典型大肠埃希菌IMViC试验结果为- + - -［14］，与大部分志贺菌反应相同，且爱德华氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌和部分志贺菌试验结果可能为+ + - -［15］。可见，在实际鉴定工作中单用任何一种生化试验方法均存在不确定性，需联用多种试验保证结果的准确性。

3.2 鉴定效率

本研究使用的PCR 法全过程耗时短，提取扩增时间可在半天内完成，且样本基因组DNA模板采用直接热裂解提取法，过程较简单，经裂解后的菌悬液样本无生物活性，后续操作过程中安全性较高；而使用生化鉴定法时，通常需培养24 h 以上，特别是甲基红试验产酸培养需3～5 d，耗时较长，试验项目多操作较烦琐。另外，生化试验中的样本多为新鲜培养物，生物安全风险较大。

3.3 小结

综上所述，本研究中建立了快速检测鉴定小儿咳喘灵颗粒中大肠埃希菌的PCR 法，其专属性和工作效率等方面相比传统微生物检测鉴定方法有较大优势，在大肠埃希菌的快速筛查鉴定工作中，使用该方法直接从供试品增菌液中提取DNA 进行检测可作为初期污染调查和溯源的优选工作手段之一。需注意的是，在TSB增菌液中提取DNA时，为保证增菌液生长浓度和提取效率，仍需考虑供试品的抑菌特性，之前应先进行方法适用性试验，确认该药品不会对大肠埃希菌产生抑菌性或采用适宜方法消除抑菌性［16］后方可进行试验。