氮、磷肥及其配合施用对条斑紫菜生长及氨基酸含量与组成的影响

李明传,崔祥宇,李信书*,何培民,徐军田,伏光辉,陈百尧

(1.江苏海洋大学 海洋科学与水产学院,江苏 连云港 222005;2.上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306;3.连云港市海洋与渔业发展促进中心,江苏 连云港 222044)

引 言

条斑紫菜(PyropiayezoensisUeda)是世界上人工栽培历史久远、经济价值很高的经济海藻之一,其年产值约18亿美元[1]。条斑紫菜主要产地分布在中国、日本和韩国,经加工烘干后制作成海苔以供食用。我国的栽培区域主要集中在苏北沿海地区。紫菜味鲜美,蛋白质含量高而质量好,无机元素非常丰富,富含膳食纤维及各种维生素[2],深受世界各地人们的喜爱。

食物蛋白质的氨基酸组成比例虽不尽相同,但其营养价值的优劣主要取决于所含必需氨基酸的种类、数量和组成比例。条斑紫菜氨基酸含量占干重的30%左右,含有人体所需的所有必需氨基酸,并且必需氨基酸含量及比例都明显高于WHO/FAO的必需氨基酸模式[3]。所以条斑紫菜的氨基酸的含量及其组成是条斑紫菜及其重要的品质性状之一,但紫菜的氨基酸含量与组成受到水流、营养盐等环境条件的影响[3]。

游离氨基酸(FAA)是指以游离状态存在的氨基酸。与水解氨基酸相比,FAA对营养的贡献不是很大,但FAA是重要的滋味物质和香味前体物质,具有酸、甜、苦、咸、鲜等多种味道[4],其中谷氨酸与天冬氨酸呈鲜味,甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸则呈甜味。研究表明FAA的含量是影响条斑紫菜风味的重要因素之一,特别是含量较大的Ala、Glu、Asp、Arg等4种主要氨基酸,被认为对条斑紫菜的风味有重要贡献[5-6]。

紫菜的生长需要大量吸收碳、氮、磷等营养元素,养殖海区的水流流速、营养盐供应及季节影响紫菜的生长和品质,影响紫菜的氨基酸组成[3,7-8]。本文探讨了硝酸氮(N)和磷酸盐(P)供应对条斑紫菜生长特性和氨基酸含量与组成的影响,为条斑紫菜的健康养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

条斑紫菜采自连云港海域养殖区,挑选出色泽鲜亮、植株长约5 cm、生长良好的个体,在10 ℃、光照度6 000 lx、光暗周期为12 h∶12 h的条件下,用过滤的自然海水在5 L的三角烧瓶中持续充气培养,培养密度约为1 g/L。每2 d换一次新鲜海水,培养4 d后备用。

1.2 试验设计与实施

1.3 生长的测定

每隔2 d测定一次藻体的鲜质量,共培养8 d。按下式计算特定生长速率(specific growth rate,SGR)[10]:

SGR=100%(ln Wt-ln W0)/t

式中,W0为初始藻鲜重(g);Wt为培养t时间藻的鲜重(g);t为试验培养的时间(d)。

1.4 游离氨基酸的测定

称取条斑紫菜0.05 g(精确至0.1 mg),放入研钵加入石英砂并滴加3 mL的磷酸缓冲液充分研磨至匀浆装。转移到离心管后,3 000×g离心5 min,过滤。按滤液体积加入等体积的7%的磺基水杨酸混合,1 h后3 000×g离心5 min,取上清液,过滤备用。

1.5 总氨基酸的测定

称取100 mg(精确至0.1 mg)紫菜于特制的水解管底部,缓慢加入4 mL 6 mol/L HCl并轻轻转动水解管,保证样品全部在试管底部并保证样品得到全部润湿,旋紧盖子。110±1 ℃水解24 h。切开水解管用去离子水全部转移到50 mL容量瓶中定容,双层滤后纸过滤,取滤液1 mL置于25 mL小烧杯中,在加NaOH的真空干燥器中蒸干(水浴加热不超过50 ℃),加入pH 2.2 HCl 1 mL溶解后,溶液转移到样品瓶中备用。

1.6 色谱条件

采用LC98-I AAA氨基酸分析系统二元梯度高效液相色谱系统及专用C18色谱柱,采用紫外检测器完成氨基酸的检测。色谱柱:氨基酸分析专用ODS柱;柱温:40 ℃;流速:1 mL/min;波长:254 nm。

1.7 数据处理

数据采用excel2007、origin7.0、N2000色谱工作站进行处理统计分析。生长结果采用双因子方差分析(ANOVA)进行显著性分析,p<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 N、P及其配合对条斑紫菜叶状体生长的影响

图1显示培养一周后在不同施肥条件下条斑紫菜叶状体的相对生长率。以N、P配合施用条斑紫菜叶状体相对生长率最高,达到14.4%,施P肥处理组的相对生长率居第二,达12.3%,仅施N肥的效果平平,相对生长率为10.5%,高于对照的9.4%。说明N和P对条斑紫菜的生长存在显著的交互作用(p<0.05),证明N、P配合极为有效。

图1 N、P及其配合对条斑紫菜叶状体生长率的影响(上标不同字母表示不同生长率之间有显著性差异,P<0.05)

2.2 不同N、P条件对条斑紫菜叶状体氨基酸含量的影响

图2清楚显示了17种标准氨基酸的出峰顺序与时间。在选定色谱条件下,17种氨基酸标准品可被充分衍生,各氨基酸衍生物依次出峰,基线平稳,分辨率高。

图2 标准品氨基酸(A)和条斑紫菜氨基酸(B)的分离色谱图(1.天冬氨酸;2. 苏氨酸;3. 丝氨酸;4.谷氨酸;5. 甘氨酸; 6. 丙氨酸;7. 胱氨酸;8. 缬氨酸;9. 蛋氨酸;10. 异亮氨酸;11. 亮氨酸;12. 酪氨酸;13. 苯丙氨酸;14. 赖氨酸;15. 脯氨酸;16. 组氨酸;17. 精氨酸)

N、P及配合施用对条斑紫菜氨基酸总含量产生不同的影响。和对照比较,N、P肥配合施用对条斑紫菜氨基酸总含量表现为互助效应,增加最多,达14.1%;而单施N肥使条斑紫菜的氨基酸总含量增加9.3%;相反,单施P肥对条斑紫菜氨基酸总含量表现为负效应,下降5.8%。N、P肥配合施用使条斑紫菜氨基酸含量增加最多的是Ala,比对照增加49.5%,其次是Phe和Val等(表1)。在条斑紫菜中8种必需氨基酸占总氨基酸含量的百分比大于40%,含量最高的3种必需氨基酸分别是Ala、Leu和Val,N、P肥配合施用均使8种必需氨基酸占总氨基酸含量的百分比有所增加。

表1 N、P及其配合对条斑紫菜叶状体氨基酸含量的影响

添加N、P肥均提高紫菜FAA的含量,单独添加P肥FAA较对照略增加8.0%,单独施氮肥FAA较对照增加32.4%,而同时施N、P肥FAA则大幅增加61.3%(表2)。不过单独添加N肥使FAA占总氨基酸百分比百分比由对照的6.78%增加到8.22%,单独施P肥使紫菜的FAA占总氨基酸百分比增加到7.77%。同时施N、P肥紫菜的FAA占总氨基酸百分比为9.58%(表2)。

表2 N、P肥及其配合施用对条斑紫菜叶状体中游离氨基酸(FAA)含量的影响

在FAA的呈味氨基酸中,芳香族游离氨基酸(Tyr+Phe)含量为0.08～0.16 mg/g,所占比例为0.3%～0.58%,添加N或P能提高芳香族游离氨基酸(Tyr+Phe)的含量。鲜味氨基酸(Asp+Glu)含量为5.6～7.24 mg/g,所占比例为21.64%～27.41%,单独添加N或P使鲜味氨基酸含量略有降低,但同时施N、P肥则使鲜味氨基酸含量略有增加。实测甜味氨基酸(Ser+Gly+Ala+Pro)含量为7.3～16.07 mg/g所占比例为28.2%～38.51%,单独或同时添加N、P肥均使甜味氨基酸含量大幅增加(图3),其中尤以Ala的增幅最大,达3.1倍(表2)。

图3 不同N、P肥条件下条斑紫菜呈味氨基酸的组成(图中数字上标字母不同表示差异显著P<0.05)

3 讨论

与陆地高等植物一样,氮和磷也是海藻生长的限制因子。近年来,由于紫菜栽培业者盲目扩大紫菜栽培面积,高密度的栽培造成海区氮、磷缺乏,严重影响紫菜的产量和品质,甚至造成大面积病害。本实验通过进行氮肥和磷肥单独施用及配合施用,可以得到这样的结论:单施氮肥无助于条斑紫菜生长,但显著促进增加氨基酸含量的增加;单施磷肥显著促进条斑紫菜生长,但使氨基酸含量降低;只有氮肥与磷肥配合施用,既显著促进条斑紫菜生长,增加鲜重,又显著增加氨基酸含量,并使呈味氨基酸增加,改善条斑紫菜食用品质,表现出氮肥和磷肥配合施用的互助效应。

单独添加氮并没有显著促进紫菜的生长,这可能因为对照的氮浓度足以维持紫菜较快的生长需要,不过很多藻类的生长率会随着叶片中氮含量下降而下降[11];也可能是因为紫菜体内贮存足够多的氮,在短期内可以提供生长所需。李信书等[8]发现,单独添加氮不能促进条斑紫菜生长,但可促进组织氮的积累,包括游离氨基酸、藻红蛋白和藻蓝蛋白在内的可溶性蛋白的合成。紫菜等红藻体内的氮含量与环境中氮含量的相关性比绿藻和褐藻要紧密得多[12]。氮以无机或有机代谢物形式贮存起来,这称之为奢侈消费或奢侈同化,这是藻类应对氮限制的生态适应机制[8,13]。尽管如此,添加氮将对提高蛋白氨基酸的含量尤其是游离氨基酸的含量大有裨益。

磷在植物代谢中非常重要,它是核酸、核蛋白和磷脂的主要成分,并与蛋白质合成、细胞分裂、细胞生长有密切关系。在磷限制的环境条件下,植物的光合作用受到严重抑制,抑制率可达50%[14]。大叶藻(Zosteramarina)在磷不限制的情况下,碱性磷酸酶活性对于优化C和N的代谢至关重要[15]。这与本文中磷与氮之间存在协同作用的结果相一致,同时添加氮磷有利于促进生长、蛋白氨基酸积累和游离氨基酸含量的提高。

紫菜中的氨基酸总量受风浪、潮流和海水中营养物等的影响[7],实际上海水流动改善了营养盐和二氧化碳的供给状况,从而影响紫菜氨基酸的含量。氨基酸含量尤其是8种必需氨基酸的含量是评价食物品质的主要依据。添加氮和磷均能提高紫菜蛋白质的含量,8种必需氨基酸所占的比例也有所提高。氮限制使提克江蓠(Gracilariatikvahiae)的游离氨基酸含量迅速下降,这意味着当外界氮源减少时,游离氨基酸充当氮贮存的功能而被利用[16]。因此在海区缺少营养盐时,适当施肥有利于提高紫菜的产量和品质。

FAA含量可以作为鱼、虾、贝等水产品鲜美度的重要评价指标[17]。Yoshie等[18]研究表明紫菜中FAA含量越高,包含的Ala、Asp、Glu和Gly等越多,就越能让人能感到紫菜的鲜美。同时添加氮磷呈甜味的Ala和Gly及鲜味的Glu都有显著提高,有利于改善紫菜的品质。马家海等[19]也认为中国产条斑紫菜的游离Ala含量较高,所以甜味较浓,这可能与中国海区营养盐供给有关。不过紫菜的品质除了受氮磷等营养盐的影响外,还受到其它因素的影响。Niwa等[6]的研究结果显示日本神户紫菜FAA中Glu含量随采收季节明显递减,认为前期采收的紫菜游离Glu含量高,口感好。纪明侯等[7]指出条斑紫菜的氨基酸含量变化随不同海区的肥度而变化,同时季节也对氨基酸的含量和组成构成影响。说明紫菜氨基酸和FAA的含量和组成除受到营养盐的影响,还可能受到温度、光照、紫菜发育阶段等因素的影响。