饲料及饲料添加剂中沙门氏菌的检验方法验证研究

刘家麒

(上海微谱检测认证有限公司,上海 200441)

随着微生物检测技术的不断发展,对于沙门氏菌的检测已有较多的检测方法。如:免疫学、分子生物学等快速检验方法[1]、基于质谱分析的方法、基于光谱分析的方法等[2],相比之下,传统技术也是目前运用和研究较多的,并在不断的优化[3]。对于每一种方法是否能够适用于该实验,则需要检验人员对不同的方法进行有效的方法验证。此研究是针对饲料及饲料添加剂中沙门氏菌的检验方法进行验证。

1 实验器材与方法

1.1 主要仪器与设备

MP1100B电子天平,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;DHP-9052 36℃培养箱、DHP-9052B 42℃培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;BSC-1304IIA2生物安全柜,苏州安泰空气技术有限公司;LDZH-100L高压灭菌锅,上海申安医疗器械厂;BILON-08无菌均质器,上海比朗仪器制造有限公司。

1.2 培养基及鉴定试剂盒

沙门氏菌标准菌株:ATCC14028鼠伤寒沙门氏菌、DHL胆硫乳琼脂,广东环凯微生物科技有限公司;RV氯化镁孔雀绿肉汤、SC亚硫酸盐胱氨酸增菌液、NA营养琼脂,青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;BPW缓冲蛋白胨水、BS亚硫酸铋琼脂、沙门氏菌干制生化鉴定试剂盒,北京陆桥技术股份有限公司。

1.3 实验培养基配制

1.3.1分析实验用水检测

配制培养基所用分析实验用水,根据国标GB4789.2-2022对菌落总数进行检测,其菌落总数为100 CFU/mL,结果<1 000 CFU/mL,符合GB 4789.28-2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》[4]。

1.3.2培养基配制

此次实验所用培养基均为成品培养基,根据培养基瓶身配制方法,准确称量配制。所有培养基现配现用,并与常规实验试剂分开存放。

1.4 样品基质及方法选择

实验选择2种不同基质的饲料及饲料添加剂样品,分别用样品A(饲料样品)和样品B(饲料添加剂样品)表示。比对实验样品为25 kg预包装鱼粉,市售。实验方法根据GB/T 13091-2018《饲料中沙门氏菌的测定》进行[5]。实验由2人同时进行。

2 检验方法

2.1 加标及前增菌

由标准菌株管理员对原始冻干粉状菌株进行复苏传代,选用2代菌株。临近验证前将菌株接出,冷藏保存,待用。全程实验在二级生物实验室生物安全柜中操作。实验室温湿度为20.0℃,50%RH。

分别无菌准确称取25 g样品A(饲料样品)和样品B(饲料添加剂样品)至均质袋中,加入225 mL BPW缓冲蛋白胨水,接菌加标,均质器充分均质3 min后放入培养箱以36℃±1℃培养18 h。

2.2 选择性增菌

样品培养8～18 h后从培养箱拿出,用移液枪无菌分别吸取1 mL BPW培养液至10 mL RV氯化镁孔雀绿肉汤、SC亚硫酸盐胱氨酸增菌液中。以42℃和36℃培养24 h。

2.3 平板分离

培养后的选择性增菌液RV氯化镁孔雀绿肉汤和SC亚硫酸盐胱氨酸增菌液均需要用接种环在BS亚硫酸铋琼脂平板和DHL胆硫乳琼脂平板上划线分离。平板分离的目的在于分离出单个菌落。划线完成后,BS亚硫酸铋琼脂平板36℃培养48 h,DHL胆硫乳琼脂平板培养24 h。

2.4 典型菌落纯化

经过分离培养后,沙门氏菌在DHL胆硫乳琼脂平板上呈黑色,在BS亚硫酸铋琼脂平板上也是黑色,有金属光泽。将典型菌落在NA营养琼脂上进行纯化,再次分离出单菌落。

2.5 血清鉴定及生化检验

挑取纯化后的典型菌落用国产O多价血清和H多价血清在载玻片上进行血清诊断。生化实验原则上可以选择全自动生化鉴定系统进行检测,但从成本控制及多方面考虑,本次实验选用成品沙门氏菌生化试剂盒,挑取经过纯化后的菌落至9 mL 0.85%无菌生理盐水中,制成0.5个麦氏浊度的均匀菌悬液,并根据说明书进行规范操作,最后盖上盒盖与三糖铁斜面统一放入36℃培养箱培养24 h。

2.6 比对实验

此次实验由2人进行,并形成结果比对。加做动物性饲料原料的测定比对实验。选用出厂检验合格的售卖鱼粉(主要成分:鳀鱼)25 kg/袋,无菌采样25 g×2份,鱼粉样品一份为正常检测,另一份加标后检测,样品以盲样形式分发给2位实验员检测,并做好标记,2位实验员在检测前均不知晓加标情况。

3 验证结果分析与讨论

3.1 验证结果

经检验,2个样品沙门氏菌典型菌落在O多价血清和H多价血清的反应下,呈凝集状态。沙门氏菌生化成品试剂盒检测结果见表1。

表1 沙门氏菌生化检验结果

通过表1可见,此次实验生化检验完全符合GB/T 13091-2018《饲料中沙门氏菌的测定》6.4.2表4中A1典型的沙门氏菌反应,并结合血清诊断,可以确定样品A(饲料样品)和样品B(饲料添加剂样品)在加标后均检出沙门氏菌。

3.2 讨论

3.2.1选择性平板的选择

本次实验选用的是BS亚硫酸铋琼脂平板和DHL胆硫乳琼脂平板,是实验室用成品培养基粉剂配制的平板,并且生长后的菌落用营养琼脂进行了纯化。在日常检测过程中,如果样品量较大,推荐使用成品平板。在沙门氏菌检测时,其实也可以使用沙门氏菌显色平板[6],经过分离的菌落在平板上呈现粉红色,较容易分辨,一般来说至少选择2种选择性平板进行分离。

3.2.2成品三糖铁和配制三糖铁的比较

生化鉴定套装中带有成品三糖铁斜面。说明书中也明确提示在三糖铁穿刺时不可将接种针穿到底部。但是在实验过程中,即使接种针没有穿到培养基底部,也可能会出现硫化氢颜色过深蔓延全部等影响观察的现象。其原因是成品三糖铁瓶身较小,斜面长度不如配制的三糖铁,且密封玻璃瓶身打开也不是特别方便。相比之下,把图1(实验室购买成品粉剂配制的三糖铁)和图2(生化试剂盒自带的成品三糖铁)生长结果进行比较,可以看出实验室自行配制的三糖铁斜面生长效果好于成品三糖铁斜面。所以在三糖铁斜面的选择上建议实验室选择购买成品粉剂进行自行配制三糖铁斜面,临近实验前配制,这样效果较好。

图1 实验室购买成品粉剂配制的三糖铁

图2 生化试剂盒自带的成品三糖铁

3.2.3血清凝集干扰

滴O多价血清和H多价血清于载玻片上,挑取选择性平板上典型菌落或分离纯化的单菌落,观察血清凝集情况,血清结果为凝集的。但是本次实验所用的沙门氏菌标准菌株——鼠伤寒沙门氏菌是有Vi抗原存在的,会影响O血清凝集,凝集不太明显。可挑取菌体至0.5～1.0 mL生理盐水中制成菌悬液,用酒精灯煮沸后再观察。

3.2.4人员比对结果差异

样品A(饲料样品)和样品B(饲料添加剂样品)在加标后由2名不同试验人员进行检测,结果均检出沙门氏菌,并有阴性对照。尽管生化反应以及血清诊断符合典型沙门氏菌生化现象。但是在检测过程中还是会出现略微差异。在平板分离时,检验人员在RV氯化镁孔雀绿肉汤和SC亚硫酸盐胱氨酸增菌液用接种环挑菌时,如果菌量过大,会出现分不出单菌落的情况,从而影响分离效果。本次试验检验人员在平板划线时均多划线几块平板,在第二区划线时对接种环进行加热灼烧,冷却后再进行下一区域划线,确保能有单菌落分离出来再进行纯化[7]。生化试剂盒的检测中,赖氨酸脱羟酶、氰化钾、靛基质、尿素等试验项目2名检测人员检测结果完全相一致。三糖铁斜面颜色略微差异,有个别出现黑色蔓延情况,用成品粉剂配制三糖铁斜面后,斜面与其他生化颜色相一致。虽然有较小差异,但此次人员比对结果仍合理有效。

动物性饲料原料的测定比对实验,对鱼粉样品及加标后样品进行检测,样品为市场正常售卖的样品。2位实验人员有1人未检出沙门氏菌,另一人检出沙门氏菌,符合原标记的阴性和阳性加标后的检测结果。未检出沙门氏菌的实验人员在用BS亚硫酸铋琼脂平板和DHL胆硫乳琼脂平板进行培养后,没有生长出典型菌落,BS亚硫酸铋琼脂平板无菌落生长,DHL胆硫乳琼脂平板生长出少量杂菌。对其做血清学实验及生化反应,不符合阳性生化特征,而加标后的鱼粉样品在平板上生长的特征及生化反应完全符合阳性结果,2人实验结果具有较大差异,该方法适用于日常的常规样品检测。

4 结论

本次试验对饲料及饲料添加剂中沙门氏菌的检验方法进行了方法验证研究。对2种不同基质的样品进行标准菌株加标检测,同时由2个实验人员完成,并进行人员比对。加标后的样品均检出沙门氏菌,动物性饲料原料的测定比对实验证实了该方法对饲料及饲料添加剂沙门氏菌的检测具有一定的适用性和可行性。目前沙门氏菌的检测方法有很多,不同基质的样品需要选择适用的检验方法。无论是传统方法还是目前较为先进、快捷的全自动生化鉴定系统检测,在运用到正式检测工作之前为保证方法的适用性都是需要进行方法验证实验。在检测方法的选择和方法验证时,我们可以根据自身实验室检测能力,综合考虑检测成本去选择实验方法、实验设备及试剂,在符合国标的前提下也可以对方法进行合理的优化,从而提升今后的检测质量。