硫酸对过氧化氢-乙酸预处理巨龙竹酶解和发酵的影响

刘高源, 史正军,2, 赵 平,2, 杨海艳,2, 杨 静,2*

(1.西南林业大学 化学工程学院,云南 昆明 650224; 2.云南省高校特色林木生物质资源化学利用重点实验室;西南林业大学,云南 昆明 650224)

巨龙竹,主要生长和分布于中国云南省的西南部,竹材结构致密形貌高大,在当地主要用作建筑材料和家具原料等,巨龙竹生长速度快,生物量含量高,因此在生物质燃料应用领域具有较高的潜力[1-2]。竹类生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素组成,三大组分之间相互交联形成了致密的天然细胞壁结构,这种复杂且性质稳定的三维网状结构成了木质纤维生物炼制过程中的天然抗降解屏障。竹类生物质中含25%～30%木质素,能够通过共价键与糖类物质连接形成木质素-碳水化合物复合物(LCC),进一步增加了木质纤维的异质性和结构复杂性,使竹类生物质难以被拆分和解聚[3]。有效的预处理能够解离木质纤维原料天然致密的结构,降低木质纤维的酶解抗性屏障。主要的预处理方法包括化学法预处理、物理法预处理、生物法预处理以及几种预处理方法的结合[4-5]。然而,根据目前的预处理水平,完全脱除木质纤维原料中的木质素需要非常高的成本,并且脱除木质素的同时会损失部分的纤维素;其次在高温预处理过程中部分木质素会从固有的状态分离降解,但不会从木质纤维原料中脱除,而是重新聚合到底物表面,继续影响纤维素酶的水解效率[6-7]。本研究以硫酸作为辅助试剂促进过氧化氢与乙酸反应生成过氧乙酸(PA),对巨龙竹进行预处理,探究预处理中硫酸的用量对巨龙竹酶水解和发酵效率的影响,以及预处理前后巨龙竹的形貌和结构变化,以期为竹类生物质生物精炼糖基化合物和纤维素乙醇的应用基础研究提供借鉴和参考。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

3年生巨龙竹(DendrocalamussinicusChia et J. L. Sun, DS),来自云南省保山市昌宁县,经风干、粉碎过筛,选粒径为0.25～0.38 mm的样品,备用。纤维素酶(Cellic CTec2),滤纸酶活为250 FPU/mL,β-葡聚糖苷酶酶活为1 120 IU/mL,购于上海Sigma-Aldrich公司;酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),购于安琪酵母股份有限公司;酵母提取物,购自北京奥博星生物技术公司;过氧化氢(质量分数30%)、乙酸和硫酸等均为分析纯。

Agilent 1260 S高效液相色谱(HPLC)仪,美国安捷伦公司;UV-210PC型紫外分光光度计,美国尤尼柯仪器公司;Aeris X射线衍射(XRD)仪,荷兰帕纳科公司;Micrometritics ASAP 2020分析仪,美国麦克默瑞提克仪器公司;X射线光电子能谱(XPS)仪,美国赛默飞公司。

1.2 过氧化氢-乙酸预处理巨龙竹

取过氧化氢和乙酸溶液各75 mL混合,然后分别加入占总体积0、 0.1%、 0.25%、 0.5%和0.75%的硫酸作为反应助剂,配制复合溶液。10 g巨龙竹粉与150 mL复合溶液混合,在70 ℃下反应2 h后,固液分离,固体残渣用蒸馏水洗涤至中性,然后在室温下风干用于后续的化学成分分析、酶水解和发酵产乙醇。

1.3 巨龙竹的酶水解

取未处理的巨龙竹原料和预处理的巨龙竹各1 g,添加10 FPU/g(以底物质量计)的纤维素酶,加入适量的柠檬酸缓冲液调节水解体系(20 mL)的pH值为4.8,在恒温振荡箱中50 ℃和150 r/min条件下反应72 h。在酶水解过程中的2、 4、 6、 10、 24、 48、 72 h的时间节点取样,用HPLC测定葡萄糖和木糖含量,平行实验3次,并取平均值。酶水解结束后取上清液保存于4 ℃冰箱,用作后续发酵产乙醇的碳源。

1.4 发酵产乙醇

将0.216 g酿酒酵母、 0.4 g葡萄糖和0.8 g酵母提取物溶于8 mL蒸馏水中,在35 ℃条件下活化30 min,制成酵母溶液。将1.3节的酶水解上清液经高压锅灭菌后,取4 mL,再加入0.5 mL配制的酵母溶液,在35 ℃条件下发酵18 h。发酵结束后,离心取上清液用于测定乙醇质量浓度。

1.5 分析与表征

1.5.1物料化学成分分析 采用美国国家可再生能源实验室(NREL)的“两步酸水解法”测定预处理前后巨龙竹的纤维素(葡聚糖)、半纤维素(木聚糖)和木质素的质量分数,预处理残渣回收率和木质素的脱除率按式(1)～(2)计算[8]:

R=(m1/m2)×100%

(1)

D=[1-(m3/m4)]×100%

(2)

式中:R—固体回收率,%;m1—预处理固体绝干质量,g;m2—原料绝干质量,g;D—木质素的脱除率,%;m3—预处理残渣中木质素质量,g;m4—原料中木质素质量,g。

1.5.2水解液中还原糖和乙醇测定 水解上清液中的葡萄糖、木糖质量浓度和发酵液中的乙醇质量浓度通过HPLC测定,所用分析柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm,9 μm),流动相为0.005 mol/L的硫酸,流速为0.6 mL/min,柱温为55 ℃,示差折光检测器下进行检测,3次平行实验并取平均值。葡萄糖、木糖和乙醇得率按式(3)～(5)计算[9]:

Y1=(C1×0.9×0.02)/(m5×w1)×100%

(3)

Y2=(C2×0.88×0.02)/(m5×w2)×100%

(4)

Y3=C3/(CG×0.51)×100%

(5)

式中:Y1—葡萄糖得率,%;C1—水解液中葡萄糖的质量浓度,g/L; 0.9—葡聚糖和葡萄糖的转化系数; 0.02—水解液体积,L;m5—原料绝干质量,g;w1—原料中葡聚糖质量分数,%;Y2—木糖得率,%;C2—水解液中木糖的质量浓度,g/L; 0.88—木聚糖和木糖的转化系数;w2—原料中木聚糖质量分数,%;Y3—乙醇得率,%;C3—乙醇质量浓度,g/L;CG—发酵液中葡萄糖初始质量浓度,g/L; 0.51—葡萄糖转化成乙醇理论值。

1.5.3疏水度测定 采用玫瑰红染色法测定物料的疏水度[10]。分别取预处理前后的底物0.04、 0.08、 0.12、 0.16和0.20 g于适量玫瑰红染色液(40 mg/L)中,在50 ℃和150 r/min条件下反应24 h。使用紫外分光光度计在波长543 nm处测定上清液的吸光值检测染料残余量,被吸附染料与残余染料比为分割熵(QP值)。以底物质量浓度为横坐标,QP值为纵坐标,进行线性拟合,所得直线的斜率即为物料疏水度,每个样品测3次,取平均值。

1.5.4酶可及度测定 采用直接红染色法[11]测定物料的酶可及度。分别将0.08 g竹粉样品加入8 mL不同质量浓度(0、 0.1、 0.5、 1、 2和3 g/L)的刚果红(DR28)溶液中,在恒温振荡箱中以50 ℃和150 r/min的条件反应24 h。取上清液于498 nm测定紫外吸光值,计算染料残余量,用Langmuir吸附等温曲线拟合竹粉对直接红染液的最大吸附量,并评价纤维素酶对物料的可及度,每个样品测3次,取平均值。

1.5.5结晶度测定 底物的纤维素结晶度(ICr)通过XRD在耙材为Cu,扫描范围2θ为5～80°条件下测定,根据结晶峰面积与总峰面积的比率计算预处理样品的结晶度。

1.5.6比表面积测定 预处理前后巨龙竹的比表面积使用BET法测定,用Micrometritics ASAP 2020分析仪在77 K下进行氮气吸附-脱附。

1.5.7XPS分析 巨龙竹表面元素分析通过XPS测定。测试条件为X射线能量1 486.8 eV,测试电压15 kV,真空2×10-7Pa。木质素和碳水化合物的表面覆盖率计算公式如下[12]:

SL=(RO/C,P-RO/C,C)/(RO/C,L-RO/C,C)

(6)

SC=1-SL

(7)

式中:SL—木质素的表面覆盖率;RO/C,P—预处理底物的氧碳比;RO/C,C—碳水化合物的氧碳比,0.83;RO/C,L—木质素的氧碳比,0.33;SC—碳水化合物表面覆盖率。

2 结果与讨论

2.1 硫酸用量对过氧乙酸预处理巨龙竹的影响

2.1.1化学成分 不同硫酸用量对过氧化氢-乙酸(PA)预处理巨龙竹化学成分的影响结果如表1所示,从表中可以看出,原料巨龙竹的纤维素(葡聚糖)、半纤维素(木聚糖)和木质素质量分数分别为50.53%、 19.18%和27.84%。经过未添加硫酸的过氧化氢-乙酸预处理(DS/PA-0)后,木聚糖的质量分数没有明显变化,木质素的质量分数减少到23.36%,比DS降低了16.1%。然而,在预处理过程中添加不同用量(体积分数)的硫酸作为助剂后,固体回收率和木质素质量分数明显降低,随着H2SO4体积分数从0.1%增加到0.75%,底物中木质素质量分数由19.09%降低到4.60%;与没有添加H2SO4的PA预处理相比,降低了18.28%～80.30%。由于木质素的大量脱除,固体回收率降低,导致预处理底物中葡聚糖和木聚糖的含量明显增加。表1中数据表明在PA预处理过程中,硫酸用量的增加,使巨龙竹原料中的木质素的脱除率增加,但对底物中葡聚糖和木聚糖的影响相对较小。

表1 硫酸用量对过氧化氢-乙酸(PA)预处理巨龙竹化学成分的影响1)

2.1.2酶解效果 10 FPU/g纤维素酶剂量和5%质量分数PA预处理巨龙竹在pH值为4.8,50 ℃和150 r/min条件下酶水解72 h,不同H2SO4用量的影响如图1所示。从图1(a)中可以看出,未预处理的巨龙竹原料经纤维素酶降解后,水解液中的葡萄糖和木糖得率分别为3.79%和4.91%。经未添加硫酸的PA预处理后,葡萄糖和木糖的得率分别为59.53%和64.47%,比原料分别提高了14.70倍和12.13倍。然而,当PA预处理过程中添加硫酸作为助剂时,预处理底物的酶水解得率呈现进一步增加趋势。当硫酸用量为0.5%时,葡萄糖和木糖的得率分别为84.77%和85.05%,达到最大值,比未添加硫酸的样品分别增加了42.40%和33.72%。但是,当进一步增加硫酸用量到0.75%时,葡萄糖和木糖得率反而降低了。这主要是因为PA预处理过程中H2SO4用量的增加能够促进过氧化氢和乙酸的反应,使其产生更多的过氧乙酸,过氧乙酸能够破坏木质素与碳水化合物复合物(LCC)之间的复合结构,甚至是木质素基本单元之间的连接键,使大量的木质素结构被破坏并溶出[13-14]。从表1可知,当硫酸用量从0.5%增加到0.75%时,底物中木质素脱除率从80.32%增加到86.53%,葡萄糖和木糖得率(图1)略有下降,表明尽管高的硫酸用量能够促进PA预处理过程中底物木质素的溶解,但是并没有增效酶解得率,可能是在预处理过程中有抑制酶水解效率的副产物附着在底物上面。

a.葡萄糖 glucose; b.木糖 xylose

2.1.3发酵效率 将不同H2SO4用量下的PA预处理巨龙竹进行纤维素酶水解72 h后,收集水解上清液。同时配制20、 30和40 g/L的葡萄糖水溶液,分别命名为Glu-20、Glu-30和Glu-40。利用酿酒酵母将水解上清液和葡萄糖溶液发酵18 h,发酵液中的葡萄糖质量浓度、乙醇质量浓度和乙醇得率如图2所示。从图中可以看出,在最初的10 h,酿酒酵母快速地转化发酵液中的葡萄糖,在16 h时葡萄糖几乎被消耗殆尽。其中巨龙竹原料发酵10 h产乙醇质量浓度和得率分别为0.196 g/L和3.48%,而DS/PA-0的水解液发酵10 h后,乙醇质量浓度和得率分别为7.80 g/L和65.25%,当添加0.5%硫酸作PA预处理的助剂后,乙醇的质量浓度和得率分别为13.52 g/L和83.24%,比DS/PA-0分别提高了73.33%和27.57%。而Glu-30的乙醇质量浓度和得率分别为14.46 g/L和88.01%,高于具有同等发酵初始葡萄糖质量浓度的DS/PA-0.5,在DS/PA-0.5发酵液中检测到了甲酸(1.23 g/L)和乙酸(0.79 g/L),这表明水解过程产生的酸类物质会阻碍酿酒酵母对葡萄糖的转化[15]。此外,发酵10 h时,乙醇质量浓度达到最高值,之后随着发酵时间的延长,乙醇质量浓度呈现下降趋势,原因可能是在失去了葡萄糖后,酿酒酵母会继续消耗溶液中的乙醇来提供能量[16]。

a.葡萄糖质量浓度 glucose mass concn.; b.乙醇质量浓度 ethanol mass concn.; c.乙醇得率 ethanol yield

2.2 巨龙竹预处理后的理化性质

2.2.1疏水度和酶可及度 不同硫酸用量下PA预处理的样品疏水度如表2所示,未处理巨龙竹的疏水度为0.871 L/g,经过无硫酸助剂的PA预处理后,底物疏水度降低到0.192 L/g,比原料降低了77.85%,说明PA预处理使巨龙竹原料中疏水性物质脱除,物料的结构或表面特征发生了变化。当在PA预处理过程中添加了硫酸作为助剂后,底物疏水度呈现进一步降低的趋势,均下降了约30%,这可能是因为随着硫酸用量从0.1%增加0.5%,木质素的脱除率从38.20%增加到80.32%,大量疏水性木质素的溶解,使底物疏水性降低,亲水性能增加,并且PA预处理也可能改变底物中残余木质素结构,进而改变底物的亲/疏水性能,而亲水性和酶可及度的提高将有利于增加底物与酶的接触,从而提高酶水解效率。酶可及度是制约纤维素酶水解效率的主要因素之一,纤维素酶对底物可及度的增加,能够提高底物对纤

表2 H2SO4用量对疏水度和酶可及度的影响

维素酶的吸附量和底物与酶蛋白之间的亲和力,进而增效纤维素酶水解效率[17]。不同硫酸用量的PA预处理的酶可及度如表2所示,巨龙竹原料的酶可及度为153.12 mg/g;经过无硫酸作助剂的PA预处理后,酶可及度提高到282.15 mg/g,较巨龙竹原料增加了86.35%,这主要是由于巨龙竹经过PA预处理后,大约30%的木质素被除去,导致纤维底物暴露,使酶可及度增加。当PA预处理采用不同用量的H2SO4作助剂处理物料时,比DS提高了大约1.9～2.3倍,酶解72 h后葡萄糖得率增加了16%～42%。当硫酸用量增加到0.75%时,酶可及度反而降低了,主要是因为预处理底物表面有木质素覆盖或者是木质素凝缩结构的增多,阻碍了纤维素对酶的吸附[18]。

2.2.2XRD分析 采用XRD测定了未处理巨龙竹、无硫酸作助剂的PA预处理巨龙竹和0.5%硫酸作助剂的PA预处理巨龙竹的结晶度,结果见图3。从图可知,巨龙竹原料的结晶度为62.35%,经过无硫酸作助剂的PA预处理后,底物(DS/PA-0)的结晶度增加到67.31%,这主要是由于在预处理过程中,无定形区的物质(如木质素)的脱除溶解,导致纤维素结晶区相对比例的增加,而经过添加0.5%硫酸的PA预处理后,底物(DS/PA-0.5)结晶度为68.51%,与DS/PA-0的结晶度相比略有增加。

图3 PA预处理前后巨龙竹的XRD图谱

2.2.3BET比表面积 通过BET法对未处理、无硫酸作助剂的PA预处理和硫酸用量0.5%的PA预处理巨龙竹的比表面积进行分析,样品的N2吸附/脱附曲线,如图4所示。

DS的BET比表面积为0.99 m2/g,经过无硫酸作为助剂的PA预处理后,DS/PA-0的BET比表面积增加到1.30 m2/g;当硫酸作为助剂添加到PA预处理过程中,DS/PA-0.5的BET比表面积进一步增加到1.41 m2/g,比原料DS和DS/PA-0分别增大42%和9%。预处理后BET比表面积的增加与样品微观结构的破坏密切相关,如大部分木质素的去除和部分半纤维素的溶解。底物比表面积增大,能够与酶有更多的接触面积,增加底物对纤维素酶的吸附量,进而增效纤维素酶水解[19]。

2.2.4XPS分析 采用XPS来分析过氧化氢-乙酸(PA)预处理前后巨龙竹表面木质素覆盖率和化学键类型的变化,如表3所示。

表3 PA预处理前后巨龙竹的表面特征

3 结 论

3.1过氧化氢-乙酸(PA)预处理能够有效地脱除巨龙竹中的木质素,随着预处理过程中H2SO4用量从0增加到0.75%,木质素脱除率从28.68%增加到86.53%;底物中大量木质素的脱除,导致葡聚糖和木聚糖的质量分数明显增加。

3.2硫酸用量对PA预处理巨龙竹酶水解和发酵产乙醇效率影响明显。预处理过程中,当硫酸用量为0.5%时,葡萄糖和木糖得率分别为84.77%和85.05%,是未添加硫酸的1.42倍;水解液经酵母发酵产乙醇质量浓度和得率分别为13.52 g/L和83.24%。

3.3在巨龙竹PA预处理过程中添加硫酸作为助剂,可以降低底物的疏水性和底物表面木质素覆盖率,增加比表面积,使纤维素酶可及度从未添加硫酸时的282.15 mg/g提高到添加0.5%硫酸的500.12 mg/g,增加了纤维素酶蛋白和纤维素之间的生产性吸附。