鸡冠状病毒感染Vero细胞后NLRP3炎症小体信号通路的活化*

刘婷婷，何炆军，黄 元，曹国领，肖从一，韩潇潇

成都医学院 生物科学与技术学院（成都 610500）

冠状病毒是人和动物的重要致病原，是具有囊膜的单股正链 RNA 病毒，囊膜表面覆有12～24 nm的棒状突起，形如花冠，故称其为冠状病毒[1]。冠状病毒属于尼多病毒目冠状病毒科，根据基因组结构相似性及血清型不同，主要分为α、β、γ和δ4 个属。鸡传染性支气管炎是感染冠状病毒后的代表性疾病，是危害养禽业的重大传染病之一。该疾病是由冠状病毒科中的禽传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起，为急性和高度接触性疾病[2]。IBV在世界范围内广泛流行，目前防控 IBV的主要措施仍然是疫苗免疫。由于IBV变异毒株不断出现且不同血清型之间交叉保护能力较差，因此IBV感染给全球养禽业造成了巨大的经济损失[3-4]。

先天免疫反应是机体抵御病原微生物的第一道防线。当病原体感染时，宿主细胞通过模式识别受体，对入侵病原体进行识别，引起先天免疫应答，进而引发一系列的炎症反应[5]。炎症小体是机体先天免疫系统中重要的成份， NLRP3 蛋白是 NLRs家族中最重要的一员，主要表达于树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞中，是目前被研究最多的炎症小体[6]。近年来的研究[7-8]表明，NLRP3 炎症小体在识别病毒感染，启动固有免疫和炎症反应方面起关键作用，病毒活化NLRP3 炎症小体有利于宿主控制病毒感染。仙台病毒和 A 型流感病毒被证明能够通过NLRP3 激活 Caspase-1，并促进IL-1β、IL-18 的生成，为含有NLRP3 的炎症小体参与病毒感染反应提供了证据。IBV感染的发病机制并未完全阐明，目前的研究认为，IBV感染过程中炎症细胞因子和免疫效应分子的激活和分泌是导致宿主靶细胞损伤的主要机制之一。IBV感染后是否会引起NLRP3 炎症小体的激活及其激活的机制仍不清楚。

因此，本研究拟建立IBV感染Vero细胞模型，通过检测IBV感染Vero细胞后不同时间点的IL-1β和IL-18的蛋白分泌量、活性氧的变化，以及NLRP3 炎症小体信号通路中相关基因表达情况，旨在探究 NLRP3 炎症小体在IBV感染中发挥的作用，也为深入了解IBV和其他冠状病毒的致病机制，以及IBV感染的新型防控手段开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、毒株与主要试剂

非洲绿猴肾细胞Vero细胞由成都医学院科研中心细胞平台保存；IBV Beaudette株由四川大学王红宁教授馈赠；改良EAGLE培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）、磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline，PBS）、双抗（青霉素链霉素溶液）购自美国HyClone公司；胰酶（含乙二胺四乙酸）购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Gemini公司；活性氧检测试剂盒、4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液购自上海碧云天生物技术有限公司；qRT-PCR引物由上海生工生物公司合成；IL-1β、IL-18细胞因子酶联免疫吸附实验试剂盒购自上海优选生物科技有限公司。

1.2 细胞培养与病毒感染

Vero细胞培养于细胞生长液（DMEM培养基+10%胎牛血清+1%双抗）中，当细胞密度达到80%～90%时，用PBS洗2～3 次，加入适当感染比的IBV Beaudette株，37 ℃吸附1 h，倾尽病毒液，加入适量的细胞维持液（DMEM培养基+2%胎牛血清+1%双抗），置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养，同时设未感染IBV的Vero细胞作为阴性对照，病毒接种后逐日观察细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。

1.3 病毒滴度测定

取对数生长期Vero细胞，将其消化为单个细胞后接种于96 孔培养板中，密度至80%～90%时将IBV病毒液用细胞维持液作连续10 倍稀释，每个稀释度分别接种8 孔，每孔100μL病毒稀释液，以细胞维持液代替病毒液作为阴性对照。将96 孔板置5% CO2、37 ℃培养箱中培养，逐日观察细胞病变，细胞产生CPE孔数，直到对照组细胞老化脱落为止，一般需要观察5～7 d。按半数效量累计法（Reed-Muench法）计算IBV的半数组织培养感染剂量（tissue culture infective dose，TCID50）[9]。

1.4 荧光显微镜下观察活性氧积聚

将Vero细胞培养于12孔板，细胞密度约80%～90%时接种感染复数（multiplicity of infection，MOI）为10的IBV，同时设不加病毒的细胞为阴性对照。设定不同时间点去除细胞培养液，加入10μmol/L的2，7-二氯荧光素二乙酸酯，加入不少于0.5 mL的细胞维持液，细胞培养箱内孵育20 min后用无血清培养基洗涤细胞3次；加入DAPI染色液，室温处理5 min 后用PBS洗涤细胞3 次。最后使用荧光倒置显微镜于525、340 nm激发波长处分别观察细胞荧光并拍照。

1.5 流式细胞术检测活性氧

将Vero细胞培养于6 孔板，细胞密度80%～90%时接种10 MOI的IBV，同时设不加病毒的细胞为阴性对照。在感染后不同时间点用胰酶消化并收集细胞，并用无血清细胞培养液洗涤3 次。用 DMEM稀释后的2，7-二氯荧光素二乙酸酯染色液处理细胞，于37 ℃下孵育20 min，期间颠倒摇晃细胞3～5 次，DMEM洗涤3 次，200μL PBS重悬后用流式细胞仪（NovoExpress，杭州艾森生物）进行检测并记录各样品的荧光强度。

1.6 酶联免疫吸附实验检测IL-18 和IL-1β

将Vero 细胞培养于6 孔板，细胞密度80%～90%时接种10 MOI的IBV，同时设不加病毒的细胞为阴性对照。在感染后不同时间点，以转速3 000 r/min，离心半径10 cm，离心10 min，并收集细胞上清液。利用酶联免疫吸附测定试剂盒分别检测细胞培养上清中IL-18和IL-1β的分泌水平。

1.7 实时荧光定量聚合酶链式反应检测炎症小体相关基因的变化

将Vero细胞培养于6孔板，细胞密度80%～90%时接种10 MOI的IBV，同时设不加病毒的细胞为阴性对照。在感染后不同时间点提取总RNA，使用反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。对cDNA进行实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitave real-time PCR，qRT-PCR）分析。反应体系包括 cDNA、SYBR qPCR Master Mix、引物（表1）以及无 RNA酶水。使用Bio-Rad IQ5热循环仪测定目的基因和内参基因（β-actin）的Ct值，以2-△△CT方法计算目的基因相对表达量的变化。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.0 统计软件对数据进行统计分析，定量资料采用（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间比较采用Dunnett's-t检验。检验水准α除特别说明外均设定为 0.05。

2 结果

2.1 IBV 在Vero 细胞中的感染情况

为验证IBV在Vero细胞中的复制情况，显微镜下观察IBV感染Vero细胞后不同时间点的形态变化。在10 MOI 病毒感染Vero细胞后，细胞在感染24 h出现细胞变圆和细胞边缘模糊，在感染36 h后呈现CPE，如细胞变圆、皱缩和脱落，同时未接种病毒细胞状态良好，未出现形态学变化（图1）。

图1 IBV 感染对 Vero 细胞形态学特征的影响

2.2 IBV 毒价测定

通过TCID50法检测病毒滴度，IBV在Vero细胞中能进行有效增殖，并计算出TCID50=10－2.875/0.1 mL（表2）。

表2 TCID50 检测病毒滴度

2.3 活性氧荧光染色

IBV感染细胞后，分别于0、12、24、30、36 h时在荧光显微镜下观察，结果显示，在×10 物镜下，12 h可观察到明显发绿色荧光的细胞（活性氧的指示信号），24 h后绿色荧光信号明显增强，且随时间延长荧光信号不断加强；对照组细胞则观察到极少绿色荧光信号。在×20 物镜下观察，结果同上（图2）。

图2 IBV感染Vero细胞中FITC与DAPI荧光共定位图

2.4 活性氧定量检测

IBV感染细胞后，分别在0、12、24、30、36 h时收集细胞进行流式检测，随着IBV感染时间延长，Vero细胞内活性氧水平逐渐升高；且与0 h组比较，12、24、30、36 h组细胞活性氧水平升高，差异有统计学意义（P<0.001）（图3）。

图3 IBV 感染处理后活性氧水平变化情况

2.5 细胞培养上清液中IL-18 和IL-1β 分泌检测

在IBV感染Vero细胞的0、12、24、36 h时收集上清液并检测IL-18 和IL-1β。随着感染时间的延长，IL-18和IL-1β蛋白的分泌量不断增加；且与0 h组比较，36 h组IL-18 和IL-1β蛋白分泌量增高，差异有统计学意义（P<0.05）（图4）。

图4 酶联免疫吸附实验检测IL-18和IL-1β蛋白分泌情况

2.6 NLRP 3 相关基因 mRNA 表达变化

使用荧光定量的方法，从基因层面分析IBV对Vero细胞NLRP3 炎症小体相关基因（Caspase-1、IL-18、IL-1β、NLRP3）的影响，由定量结果可知，在IBV感染细胞后，与0 h组比较，36 h组NLRP3的mRNA水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）（图5A）；与0 h组比较，36 h组Caspase-1和IL-18的mRNA水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）（图5B～C）；与0 h组比较，24 h组和36 h组IL-1β的mRNA水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）（图5D）。

图5 NLRP3 相关基因表达情况

3 讨论

目前研究[10]证实，多种病毒感染靶细胞后均可激活炎症小体，诱发局部炎症反应，以及后续的免疫应答。与此同时，病毒也使用多种策略以逃逸炎症小体的识别，从而使自身能够在细胞内复制增殖[11]。已有研究[12-13]表明，IBV 感染宿主后靶器官出现促炎性细胞因子IL-1β和炎症小体特征性活化物IL-18 的分泌增加，且促炎性细胞因子是由巨噬细胞在靶器官聚集并激活而分泌的，但其机制不明。细胞培养是增殖和研究IBV的一个重要方法。此前，IBV体外感染模型主要为鸡胚原代细胞，但原代细胞存在分离困难、易污染的问题。因此，关于IBV感染后免疫或炎症通路变化的研究并不深入[14]。在过往研究[15]中，本研究所选取的IBV Beaudette株在SPF鸡胚中传三代后，然后将鸡胚培养毒株接种于Vero细胞并传代至65 代，发现IBV可在细胞中适应并稳定复制传代。因此，本研究验证IBV Beaudette株在Vero细胞中的感染情况，结果表明该毒株在感染细胞24 h后便可出现明显细胞病变，且通过毒价测定证实IBV可在Vero细胞中有效增殖。

炎症小体有3 种激活模型。第1 种为离子通道模型。离子通道模型主要分为钾离子通道模型和钙离子通道模型。较早发现能激活NLRP3 的离子通道蛋白是流感病毒的M2 蛋白。第2 种为线粒体产生活性氧模型[16]。第3 种为溶酶体破裂模型[17]。由病毒直接引起的氧化应激在许多病毒感染性疾病中具有潜在的重要致病机制[18]。活性氧普遍被认为是一种细胞代谢的毒性产物，在活性氧及细胞毒素的作用下，JNK激酶被激活并转移到细胞核内，促进焦亡相关基因的表达，启动焦亡的形成[19]。活性氧损伤可诱导致敏的巨噬细胞产生NLRP3 依赖性IL-1β的分泌[20]。因此本研究证实，IBV感染后能够引发Vero细胞活性氧的积聚，并随时间增加而增长。但NLRP3 炎症小体的激活与活性氧活化相互作用的机制仍需进一步探索。

多种病毒感染靶细胞后均可激活炎症小体，诱发局部炎症反应，以及后续的免疫应答。与此同时，病毒也使用了多种策略逃逸炎症小体的识别，从而使自身能够在细胞内复制增殖[21]。据研究[22]报道，SARS-CoV-2 可能直接激活NLRP3 炎症小体，进而产生内源性佐剂活性，从而对病毒产生适当的适应性免疫应答。经典的NLRP3 炎症小体活化由两种信号共同刺激激活。第一信号激活TLRs信号通路，促进核转录因子kB激活介导IL-1β和IL-18 等前体产生；第二信号促进NLRP3/ASC/pro-caspase-蛋白复合物组装，pro-caspase-1 自剪切成活化形式，活化的caspase-1 将IL-1β和IL-18 前体剪切活化释放到胞外[23]。有研究[24]表明，甲型流感病毒在宿主细胞被感染时，能够激活NLRP3 炎症小体，促使pro-IL-1β和pro-IL-18 剪切成熟的IL-1β和IL-18，并分泌至胞外，进而引发炎症反应。本研究发现，IBV感染Vero细胞后，细胞上清液中可检测出IL-1β和IL-18的分泌量，且炎症相关基因Caspase-1、IL-18、IL-1β和NLRP3的mRNA表达量均升高。因此，本研究证实，IBV感染可引起细胞炎症小体相关通路的活化。

综上所述，本研究发现，IBV可成功感染非洲绿猴肾细胞模型Vero细胞，并在该细胞中有效增殖。IBV可通过形成NLRP3 炎症小体，进一步活化Caspase-1，最后促进IL-1β和 IL-18 分泌，以发挥抗感染作用。NLRP3 炎症小体的激活可能与活性氧积聚有关。本研究结果可为IBV及其他冠状病毒的感染机制研究奠定基础，为IBV感染新型防控手段的开发提供理论依据。