微小RNA-3679与小鼠异种移植物肿瘤生长的关系研究*

何静宇，周雪琴，李艺明，王文涛

1.绵阳市第三人民医院•四川省精神卫生中心 肝胆胰外科（绵阳 621000）；2.四川大学华西医院 肝脏外科（成都 610041）

微小RNA（micro-ribonucleicacid，miRNA）是由约为22 个核苷酸组成的一类内源性非编码RNA，为高度保守的非编码小分子单链RNA，家族成员众多，随着分子生物学的进展，不断有新的家族被发现，其主要以单拷贝、多拷贝、基因簇等形式广泛存在于真核生物中，在动植物中参与转录后调控基因表达[1-2]。 miRNA可通过与靶基因的3′非翻译区（3′-untranslated region，3′-UTR）结合，抑制靶基因的表达或促进其降解，并参与细胞内的转录后调节[3]，其虽然不能直接编码蛋白质，但目前估计约30%的人类编码基因受miRNA 的调控[4]，通过转录后调节超过60%的人体蛋白质编码基因[5]。因此，miRNA参与机体多种生理病理过程及生物学功能，并在肿瘤的发生、发展中起重要作用。研究[6-11]表明，部分miRNA家族成员可作为众多肿瘤预后指标及治疗靶点。miRNA-3679 是miRNA家族成员之一，在肺鳞癌[12]、冠状动脉钙化[13]、骨质疏松[14]、结肠癌[15]、胰腺癌[16]等方面有所研究，但均未涉及到与下游靶基因关系的验证及机制研究。目前国内外未见相关文献报道miRNA-3679 与肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的关系、是否影响其进展等。前期课题组通过临床及细胞学实验证实，miRNA-3679 可通过ZADH2靶基因发挥促进肝癌细胞增殖。本研究将通过裸鼠成瘤实验，进一步验证miRNA-3679、ZADH2与HCC的关系。

1 材料与方法

1.1 主要材料

空军军医大学动物中心提供的雄性BALB/c裸鼠（18～22 g）；miRNA第一链cDNA合成试剂盒（货号：B532451-0020）、miRNA实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）试剂盒（货号：B532461-0002）购自上海生物工程有限公司；miRNA-3679-Forward序列（由西安擎科泽西生物科技有限公司设计）：5′-TGAGGATATGGCAGGGAAGGGGA-3 ′；miRNA-3679-Reverse：Universal oligo dT primer；ZADH2-Forward：5′-TAGAATCCTGCGCTCACTGC-3′；ZADH2-Reverse：5′-GGATTCGCGCATTTGGAGAC-3′；GAPDH-Reverse：5′-GGGGTCATTGATGGCAACA ATA-3′；GAPDH-Forward：5′-ATGGGGAAGGTG AAGGTCG-3′；Lipofectamine 3000（购自美国加利福尼亚州Invitrogen公司，货号：L3000015）；Ki-67（货号：27309-1-AP）、BAX（型 号：60267-1-Ig）、BCL2（型号：60178-1-Ig）、Caspase 3/P17/P19（型 号：66470-2-Ig）、Caspase 9/P35/P10（型号：66470-2-Ig）及GAPDH单克隆抗体（型号：BL006B）均购自美国芝加哥Proteintech公司； Anti-Rabbit IgG antibody（二抗，购自广州赛国生物科技有限公司，型号：BL003A）；Anti-Cleaved Caspase-9 抗体（一抗，购自英国剑桥Abcam公司，型号：AB2324）。

1.2 主要方法

1.2.1 实验分组 将裸鼠随机分为3 组，空白对照组（NC组），抑制miRNA-3679 组（miRNA-3679 inhibitor，CT1组）及同时转染miRNA-3679 inhibitor与si-ZADH2组（miRNA-3679 inhibitor+si-ZADH2，CT2 组），每组各40 只。

1.2.2 裸鼠成瘤、瘤体质量及体积测定 采用转染miRNA-3679 inhibitor、同时转染miRNA-3679 inhibitor与si-ZADH2的Hep3B细胞，以0.25 mL的含2.0×106个细胞重悬于0.25 mL的PBS中，将0.25 mL细胞悬浮液皮下注射到每只裸鼠中，测量异种移植物肿瘤的大小。使用卡尺获得长度、宽度和厚度的测量值，计算肿瘤体积。分别于7、14、21、28 d，取裸鼠10 只，静脉麻醉后取出肿瘤并称质量，肿瘤组织用于进一步研究。

1.2.3 qPCR 采用Trizol法提取RNA，Nanodrop 2000 检测肝癌细胞系RNA浓度及纯度，反转录，qPCR检测。结果处理：ΔΔCT法：A=CT（目的基因，待测样本）－CT（内标基因，待测样本），B=CT（目的基因，对照样本）－ CT（内标基因，对照样本），K=A－B，表达倍数=2－K。

1.2.4 蛋白质免疫印迹 所有蛋白样品调至相等浓度后上样，分别上样10μL，样品两侧泳道用相同体积的缓冲液上样，Marker也用等体积缓冲液调整至与样品相等的体积，以70 V电压进行稳压电泳，当蛋白marker分离开来时，电压调节至120 V 进行稳压电泳，待溴酚蓝泳动至距胶下缘1 cm处结束电泳。电泳结束前准备、取胶、转膜，封闭、洗涤，结合一抗、洗涤，结合二抗、洗涤，采用增强化学发光法鉴定。

1.2.5 石蜡切片免疫组织化学 石蜡切片脱蜡至水，血清封闭，加一抗、二抗，AEC显色，复染细胞核，封片，显微镜镜检，图像采集分析。结果判读：苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色。

1.3 统计学方法

采用IBM SPSS Statistics 22.0 统计学软件进行分析，定量资料采用（）描述，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Dunnett'st检验，检验水准α除特别说明外均设定为0.05。

2 结果

2.1 3 组瘤体体积大小和质量比较

分别于7、14、21、28 d对裸鼠体内瘤体体积及质量测定，结果显示，在28 d时，CT1组肿瘤体积、质量均小于NC组和CT2组，差异有统计学意义（P<0.01）（图1）。

图1 3 组瘤体体积大小和质量

2.2 qPCR 检测各组miRNA-3679 及ZADH2 表达水平

CT1组及CT2组中miRNA-3679的表达低于NC组，但CT2组中miRNA-3679的表达高于CT1组（P<0.01）；CT1组中的ZADH2表达高于NC组和CT2组（P<0.001）（图2）。

图2 各组miRNA-3679 及ZADH2 的表达水平

2.3 蛋白质免疫印迹检测ZADH2 蛋白表达

与NC组比较，CT1 组中的ZADH2 蛋白表达明显升高（P<0.001）；CT2组ZADH2蛋白表达低于CT1组（P<0.001）（图3）。

图3 各组ZADH2 相关蛋白表达

2.4 蛋白质免疫印迹检测相关凋亡蛋白的表达

Bax、Caspase-3、Caspase-9 蛋白表达在CT1 组高于NC组和CT2 组（P<0.05）；但Bcl-2 蛋白表达在CT1组低于NC组和CT2 组（P<0.05）（图4）。

图4 蛋白质免疫印迹检测相关凋亡蛋白表达

2.5 免疫组织化学染色测定Caspase-3 的表达

免疫组织化学染色测定显示，CT1组的Caspase-3蛋白表达高于NC组和CT2组，差异有统计学意义（P<0.001）（图5）。

图5 免疫组织化学染色测定Caspase-3 的表达（×200）

2.6 Ki-67 免疫组织化学染色分析各组细胞增殖情况

抑制miRNA-3679 后，CT1 组肿瘤细胞数量少于NC组（P<0.01），CT2 组肿瘤细胞多于CT1 组（P<0.01）（图6）。

3 讨论

miRNA通过转录后调节因子，对机体很多生物学过程产生重要的影响，可影响肿瘤细胞凋亡、分化及肿瘤转移等[17]；ZADH2基因因可塑性相关基因蛋白3（plasticity-related-gene 3，PRG-3）被熟知。PRG-3 是PRGs家族中的一员，目前已发现5 种PRG，均属于脂质磷酸酯酶超家族，主要表达于中枢神经系，扮演Ⅱ型跨膜蛋白的作用，并且在神经元的环境中，可抑制由神经突生长抑制剂（如LPA和Nogo-A）诱导的RhoA依赖性轴突塌陷信号[18]。与其他PRG相比，PRG3 没有表现出明显的胞外磷酸酶活性，并且在细胞外区域，PRG3 不携带任何关键氨基酸[19]。尽管PRGs是一神经元家族基因，但PRG3 在选择细胞群方面似乎起着独特的作用，它不仅限于中枢神经系统组织，在其他脏器如肝脏、心脏、肺部等都有表达[20]。Choi等[21]报道，ZADH2基因异常与血清中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的升高有关，VEGF在肿瘤的增殖、转移及侵袭等方面发挥重要作用[22]。课题组通过前期实验证实，miRNA-3679 可通过抑制ZADH2靶基因促进HCC细胞增殖、存活，并抑制其凋亡。本研究将验证miRNA-3679 与ZADH2 在小鼠异种移植物（Hep3B）肿瘤中的作用，以进一步阐述miRNA-3679、ZADH2 与HCC的关系。

为研究miRNA-3679、ZADH2 对裸鼠成瘤的影响，分别于7、14、21、28 d对小鼠体内瘤体体积及质量测定，结果显示，随着时间的推移，肿瘤体积及质量均逐渐增加，在28 d时，CT1 组肿瘤体积、质量均小于NC组和CT2 组，说明抑制miRNA-3679 的表达可抑制小鼠体内的肿瘤生长，但同时抑制其下游靶基因ZADH2后，抑制肿瘤生长的作用明显降低，说明抑制ZADH2后可阻断该途径抑制肿瘤的生长。因此，miRNA-3679 可通过下游靶基因ZADH2发挥促进肿瘤生长的作用。

本研究通过qPCR检测各组癌组织中的miRNA-3679及ZADH2含量，结果提示，抑制miRNA-3679后可促进小鼠体内肿瘤中ZADH2的表达，同时抑制miRNA-3679及ZADH2 后，瘤体内ZADH2 的表达明显降低，提示miRNA-3679与ZADH2存在单向作用的关系。进一步蛋白质免疫印迹检测各组相关蛋白表达，亦得出相同趋势，说明miRNA-3679可通过ZADH2途径发挥生物学效应。

细胞凋亡是一个受多种基因精确调控的、主动的、程序化的死亡过程[23]。传统的凋亡包含3个主要途径：Bcl-XL和Bcl-2相关蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）介导的信号通路，线粒体和死亡受体诱导的途径以及经内质网途径介导的途径。这些途径涉及到活性氧的产生和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族参与胞内信号转导通路[24]。肿瘤发生与发展常伴随肿瘤细胞的凋亡受到抑制。研究[25]表明，HCC细胞的凋亡与组织学分级、淋巴结转移和临床分期密切相关。细胞凋亡主要由Caspase家族蛋白介导，其中活化的Caspase-3（Cleaved-Caspase-3）是细胞凋亡的主要执行蛋白[26]。Bcl-2属于抗凋亡蛋白，而Bax是一种促凋亡蛋白。当细胞接收到凋亡信号时，Bax促使线粒体中的凋亡因子释放，激活Caspase-3 形成 Cleaved-Caspase-3，从而促进细胞凋亡[27]。为研究miRNA-3679和ZADH2对小鼠体内肿瘤凋亡的影响，本研究使用蛋白质印迹技术检测各组肿瘤组织相关凋亡蛋白（如pro-Caspase-9、Cleaved-Caspase-9、pro-Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2）表达水平。结果提示，抑制miRNA-3679 后，小鼠体内肿瘤凋亡蛋白（Bax、Caspase-3、Caspase-9）的表达增加，但同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达。然而，在抑制ZADH2后，这种促进作用被阻断。免疫组织化学染色结果显示，CT1 组的Caspase-3 蛋白表达高于NC组和CT2 组，说明抑制miRNA-3679并靶向ZADH2基因，可促进凋亡蛋白的产生，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而促进肿瘤细胞凋亡。因此，这可能成为1个潜在的治疗靶点。

肿瘤细胞的增殖能力及细胞存活能力与肿瘤的侵袭性密切相关。李利容等[27]认为，细胞周期的调控与肿瘤的发生及发展关系密切，细胞周期机制调控受损可导致机体细胞的恶性增殖、侵袭性增加及异常凋亡等现象，肿瘤发生与发展常伴随肿瘤细胞的凋亡受抑制。因此，为了解miRNA-3679 和ZADH2 对小鼠体内肿瘤细胞增殖的影响，本研究进行了免疫组织化学染色评估，结果提示，抑制miRNA-3679 后，CT1 组肿瘤细胞数量明显少于NC组，而CT2 组肿瘤细胞明显多于CT1组（P<0.01）。结果提示，抑制miR-3679 可抑制小鼠体内肿瘤细胞的增殖，但ZADH2可以阻断该途径。

综上所述，miRNA-3679 可以促进小鼠异种移植物（Hep3B）肿瘤的发生与发展，它通过下游靶基因ZADH2发挥作用。