基于HPLC-Q-TOF-MS技术分析益气生津袋泡茶的化学成分及入血成分

王宏蕾 肖 薇 吴剑坤

首都医科大学附属北京中医医院药学部，北京 100010

益气生津袋泡茶由西洋参、生黄芪、麦冬、石斛等 十味中药组成，为一种茶散剂[1]，具有益气养阴、生津止渴，润肺清胃，滋肾宁心的功效，为首都医科大学附属北京中医医院院内制剂，由王为兰、夏军及毛克臣三位中医药专家在糖尿病气阴亏虚的中医病机研究基础上研制而成，临床应用30 余年。研究证实，其在改善糖代谢及治疗干燥综合征等方面取得了较好的效果[2-5]。但是目前尚未开展其化学成分相关研究，药效物质基础仍不明确。分析入血成分可快速、准确地解析中药药效物质，也是中药质量标志物筛选的重要依据，是快速确定中药体内药效物质的有效途径之一[6-8]。基于此，鉴定益气生津袋泡茶的化学成分及入血成分成为重中之重。液质联用技术以其快捷、高灵敏度、高分辨率等特点被广泛应用于中药原型成分与代谢产物的鉴别[9-11]。因此，本研究采用HPLC-Q-TOF-MS 技术对益气生津袋泡茶的化学成分进行鉴定，并在此基础上对其入血成分进行分析表征，以期为益气生津袋泡茶的质量控制和药效物质基础的研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1 实验仪器

Agilent 1200 型高效液相色谱柱仪（美国Agilent公司）；TripleTOF 5 600 四级杆飞行时间质谱（美国AB Sciex 公司）；BT25S 型电子分析天平（精度0.01 mg，德国Sartorius 公司）；BSA6202S 电子分析天平（精度0.01 g，Sartorius 公司）；1-15PK 型高速冷冻离心机（德国Sigma 公司）；CM-12 型水浴氮吹仪（北京成萌伟业科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

益气生津袋泡茶为首都医科大学附属北京中医医院自制；毛蕊异黄酮葡萄糖苷（成都普菲德生物技术有限公司，批号：140326）；人参皂苷Re（上海源叶生物科技有限公司，批号：P27N6F6512）；甜菜碱、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1（中国食品药品检定研究院，批号：110894-201604、110704-201223、110703-201128）；哈巴俄苷、哈巴苷、毛兰素（南京狄尔格医药科技有限公司，批号：D22052910、D22062177、D21080111）。色谱级甲酸、甲醇和乙腈（美国Fisher 公司）。

1.3 实验动物

8 周龄SPF 级SD 雄性大鼠6 只，体重280～300 g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号为：SCXK（京）2019-0010，质量合格证号为：No.110324221103743637。本研究涉及的实验动物方案已得到北京中医药大学实验动物伦理委员会的批准（BUCM-4-2022061502-2062）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 益气生津袋泡茶水提物制备称取益气生津袋泡茶内容物100.13 g，加8 倍量去离子水，回流提取2次，每次30 min，纱布滤过，合并两次提取液，50℃水浴蒸至稠膏状，转移至50 ml 量瓶中，离子水定容，得生药浓度为2 g/ml 的水提物稠膏，-20℃保存。分析前，取稠膏适量，稀释40 倍，0.22 μm 滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.2 灌胃液制备取“2.1.1”项制备的水提物稠膏适量，用0.5%羧甲基纤维素钠溶液制成生药质量浓度为1 g/ml 的混悬液，4℃储存，作为灌胃液备用。

2.1.3 混合对照品溶液制备 分别精密称取9.78 mg 毛蕊异黄酮葡萄糖苷、8.93 mg 甜菜碱、9.34 mg 人参皂苷Rb1、10.02 mg 人参皂苷Rg1、9.53 mg 人参皂苷Re、9.64 mg 哈巴俄苷、9.71 mg 哈巴苷、11.33 mg 毛兰素，加甲醇超声溶解并稀释，制成浓度约为10 μg/ml 的混合对照品溶液。

2.2 动物实验

采用随机数字表法将6 只大鼠分为给药组与空白组，每组3 只。给药组灌胃4 ml 益气生津袋泡茶灌胃液，空白组灌胃4 ml 生理盐水，2 次/d，连续给药，第4 天上午给药2 h 后麻醉大鼠，腹主动脉采血并置于4℃以备后续处理分析。

2.3 血浆样品处理

血浆样品分装于离心管中，4℃，3 500 r/min 离心15 min（离心半径为10 cm，下同），取上清液，加入等体积乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀2 min，4℃10 000 r/min离心10 min，吸取上清液用氮吹仪吹干，加50%甲醇200 μl 复溶，4℃，10 000 r/min 离心10 min，取上清液上样分析。

2.4 色谱条件与质谱条件

2.4.1 色谱条件WatersXselectHSST3C18色谱柱（50mm×2.1 mm，2.5 μm）；流动相为0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～3 min，15%B；3～6 min，15%B →35%B；6～17 min，35%B→65%B；17～18 min，65%B→95%B；18～22 min，95%B；22～23 min，95%B→15%B；23～27 min，15%B。柱温40℃，流速0.3 ml/min，进样体积3 μl。

2.4.2 质谱条件 电喷雾离子源；分别采用正、负离子模式检测；质量扫描范围为m/z 100～1 300；喷雾电压4 500 V；离子化温度500℃；碰撞能量35 eV；气帘气30 psi；喷雾气和辅助加热气分别为40、50 psi；去簇电压100 V。

2.5 益气生津袋泡茶提取物中化学成分鉴定

采用Analyst 1.7 软件进行质谱数据采集与分析，对照品溶液与水提物的总离子流图见图1。通过质谱裂解碎片分析、对照品确认及相关文献[12-13]报道数据进行比对，共鉴定出17 种化学成分，包括1 个生物碱类成分、1 个黄酮苷类成分、1 个甾体皂苷元、2 个环烯醚萜苷类成分与12 个人参皂苷类成分。鉴定出的化学成分的详细信息见表1。

表1 益气生津袋泡茶中成分的鉴定结果

图1 总离子流图

化合物鉴定时，其中8 个化合物经对照品比对后确认，剩余9 个化合物通过与文献报道的质量数与二级谱数据对比后鉴定。以化合物4 的鉴定过程为例进行详细的说明。化合物4 在负离子模式下准分子离子峰m/z 为783.488 5[M-H]-，元素组成分析，推测该化合物的分子式为C42H72O13（-0.5 ppm）；其特征离子峰为连续脱去两分子葡萄糖生成m/z=621[M-H-Glu]-和459[M-H-2Glu]-，以及苷元上C-20 位脱掉侧链后的碎片离子m/z=375[M-H-2Glu-C6H12]-，与人参二醇型皂苷[14]的裂解规律一致，且二级谱数与人参皂苷F2一致[12]，因此推测该化合物为人参皂苷F2。

2.6 益气生津袋泡茶入血成分鉴定

给药组大鼠的血清样品中共鉴定出8 个原型吸收入血的成分，分别为甜菜碱、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、哈巴俄苷、拟人参皂苷F11、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、毛兰素，其中5 个人参皂苷类成分均来源于西洋参。

3 讨论

益气生津袋泡茶临床用量为10～30 g 生药/d，基于人体平均重量60 kg 及人与大鼠剂量换算（系数6.3），280 g 大鼠给药剂量应为1.5～4.5 g 生药/d。而本研究中给药剂量为8 g/d，约为临床给药剂量的2倍，是考虑到体内血中成分的含量往往很低，目前的技术存在检测困难的问题。因此，在保证给药剂量安全的情况下，通过提高给药浓度及3 d 多次给药的方式，增加血中成分的浓度，以满足检测的要求。此外，由于中药复方中化学成分复杂，常包含多种类型的化学成分，而有些化学成分在正、负离子模式下的响应差异较大[15-17]，同时，复方中各化学成分的含量存在显著差异[18-20]。因此，为了实现对复方中化学成分进行较全面的表征，本研究分别采用正、负离子模式采集，对益气生津袋泡茶的主要化学成分进行定性识别。

目前研究表明，西洋参总皂苷[21-22]及多种人参皂苷单体如人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rg2 等能通过改善胰岛素抵抗，增强葡萄糖摄取，抑制葡萄糖输出，抑制肝脏糖异生及缓解糖脂代谢等途径来调节机体的糖代谢[23-25]。而本研究发现，益气生津袋泡茶中含有丰富的人参皂苷类成分，且多种皂苷被发现均能以原型方式入血（如人参皂苷Rb1、Re）。推测这些成分可能是益气生津袋泡茶改善糖代谢功效的物质基础。综上，本研究基于HPLC-Q-TOF-MS 技术对益气生津袋泡茶中的主要活性成分进行快速识别，为明确其药效物质基础提供了一定的科学依据，也为该药的质量控制、剂型改进及进一步临床研究奠定了理论基础。