15 个产地玄参中哈巴苷与哈巴俄苷含量测定

任 丹，齐方圆，黄紫妍，秦路平，朱 波 （. 浙江中医药大学药学院，浙江 杭州， 30053；2. 陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳， 72046）

玄参别名元参、黑参、浙玄参等，为我国传统大宗药材，主产地为浙江、安徽、四川、贵州等地[1-2]。玄参，始载于《神农本草经》，被列为中品，味甘、苦、咸，性微寒[3]；归肺、胃、肾经，具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结的功效，常用于热病伤阴，舌绛烦渴，津伤便秘、目赤、咽痛等症[4-5]。环烯醚萜苷类是玄参的主要有效成分，包括哈巴苷、哈巴俄苷等，临床上主要用于脑缺血、高血压、糖尿病等疾病，具有抗炎、保护心血管、抗肿瘤、免疫调节等作用[6-9]。

关于不同产地玄参有效成分含量测定的报道较少，仅有的报道也只集中在少数产地[10-11]。玄参药材原植物生长环境差别大，不同的生境因子下药材质量参差不齐，且在栽培过程中，栽培品系繁多混杂，严重阻碍了玄参产业的可持续发展。2020版《中国药典》规定将哈巴苷、哈巴俄苷作为玄参药材的质控成分，现代药理学研究也表明哈巴苷、哈巴俄苷具有保护心血管、保护神经的药理作用[12-13]。因此，课题组以哈巴苷和哈巴俄苷成分为指标性成分，收集全国玄参15 个主产区玄参种质资源，建立HPLC 法对其进行含量测定，分析不同产地玄参环烯醚萜苷类成分之间的差异性，以期为玄参药材质量控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药材

2019 年11 月至2019 年12 月，收集浙江磐安、安徽谯城区、贵州阳溪、河南朱庄、四川陇东等15 个产地新鲜玄参种质资源，经浙江中医药大学药学教研室秦路平教授鉴定为玄参科植物玄参（Scrophularia ningpoensisHemsl.）的干燥根，信息见表1。

表1 不同产地玄参样品信息

1.2 仪器与试剂

Waters Alliance e2695 型高效液相色谱仪(美国Waters 公司）；ZORBAX Eclipse C18色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；XS105 型电子分析天平（梅特勒-多利多公司）；超纯水仪（美国Millipore 公司）；DXF–60D 型中药打粉机（广州市大祥电子机械设备有限公司）；KQ–300DV 型超声波（广州颖汉科技有限公司）；DHG–9031A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信试验仪器有限公司）。哈巴苷（B20481）、哈巴俄苷（B20480）对照品均购于上海源叶生物科技有限公司。乙腈（色谱级，美国天地公司），磷酸（色谱级，上海阿拉丁公司），其余试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）–0.03%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（1～10 min，3%～10% A；10～20 min，10%～33% A；20～25 min，33%～50% A；25～30 min，50%～80% A；30～35 min，80% A；35～37 min，80%～3% A；37～42 min，3% A）；体积流量1.0 ml/min，柱温30 ℃，进样量为10 μl；检测波长为210、280 nm。色谱图见图1。

1.3.2 线性关系考察

精密称取哈巴苷、哈巴俄苷对照品适量，用30%甲醇溶液制备成终质量浓度为每1 ml 含哈巴苷0.6 mg、哈巴俄苷0.2 mg 的混合对照品溶液，于4 ℃冰箱中保存备用。分别精密吸取哈巴苷、哈巴俄苷混合对照品溶液0.34、0.67、1.00、1.40、1.70 ml 置于2 ml 容量瓶中，30%甲醇溶液定容至2 ml，吸取上述溶液适量，0.45 μm 微孔滤膜过滤，按“1.3.1”项下色谱条件依次进样。哈巴苷的检测波长为210 nm，哈巴俄苷的检测波长为280 nm。以对照品溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表2，可知哈巴苷与哈巴俄苷在各自范围内线性关系良好。

表2 线性关系考察

1.3.3 供试品溶液制备

将洗净后的玄参根切片，置于60 ℃烘箱中烘至恒定质量，粉碎后过3 号筛。精密称取玄参根样品粉末0.25 g，置于25 ml 具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25 ml，密塞，称定重量，浸泡1 h，超声处理45 min（300 W, 40 kHz），放冷，再称定重量，用50%甲醇溶液补足损失的重量，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。按“1.3.1”项下色谱条件平行测定3 次。

1.3.4 精密度试验

精密吸取哈巴苷、哈巴俄苷对照品溶液适量，按“1.3.1”项下色谱条件依次进样6 次，测得哈巴苷、哈巴俄苷峰面积RSD 分别为0.11%、0.09%，表明仪器精密度良好。

1.3.5 稳定性试验

取浙江磐安样品，按“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、18、24 h，按“1.3.1”项下色谱条件进样，测得哈巴苷、哈巴俄苷峰面积RSD 分别为0.24%、0.17%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

1.3.6 重复性试验

取浙江磐安样品6 份，按“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件进样，测得哈巴苷、哈巴俄苷含量的RSD 分别为0.59%、0.50%，表明该方法重复性良好。

1.3.7 加样回收率试验

取含量已知的浙江磐安样品，精密称定0.125 g,加入哈巴苷、哈巴俄苷对照品适量，按“1.3.3”项下方法制备成供试品溶液，按“1.3.1”项下色谱条件进样，计算回收率，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果（n=6）

1.4 数据处理与分析

应用SPSS 19.0 软件处理数据。方差分析采用单因素ANOVA 分析，聚类分析采用组间连接法[14]。

2 结果与分析

2.1 哈巴苷与哈巴俄苷含量比较

15 个产地间玄参根中哈巴苷、哈巴俄苷的含量存在统计学差异（P<0.01），结果见表4。哈巴苷、哈巴俄苷含量以及两者总量分别为0.791、0.228、1.265 mg/g。四川陇东产哈巴苷含量最高、安徽谯城区含量最低；浙江磐安产哈巴俄苷含量最高，四川永富含量最低；四川陇东产哈巴苷与哈巴俄苷总量最高，杭州植物园最低,含量范围在0.752～1.529 mg/g之间，均符合《中国药典》2020 版质量标准。

表4 不同产地间玄参样品中各成分含量测定结果（±s，n=3，mg/g）

表4 不同产地间玄参样品中各成分含量测定结果（±s，n=3，mg/g）

**P<0.01，表示不同产地的哈巴苷或哈巴俄苷含量存在极显著差异。

样品 哈巴苷含量 哈巴俄苷含量 哈巴苷与哈巴俄苷总量S10.598±0.0030.852±0.0031.450±0.006 S20.979±0.0020.520±0.0041.499±0.006 S30.600±0.0070.152±0.0090.752±0.013 S40.625±0.0030.542±0.0031.167±0.004 S50.489±0.0020.831±0.0081.320±0.009 S60.558±0.0030.615±0.0061.173±0.009 S70.730±0.0210.626±0.0171.355±0.038 S80.921±0.0070.563±0.0061.484±0.002 S90.642±0.0040.655±0.0041.297±0.008 S101.147±0.0060.382±0.0021.529±0.008 S110.992±0.0160.036±0.0021.029±0.017 S120.560±0.0020.422±0.0010.983±0.002 S130.759±0.0060.385±0.0051.144±0.009 S141.120±0.0090.234±0.0151.355±0.024 S151.140±0.0070.297±0.2941.434±0.010均值0.791**0.228**1.265**

2.2 相关性分析

对不同产地之间中的有效成分与生境因子进行相关性分析，结果如表5 所示，哈巴苷与海拔、降雨量、年平均温度呈正相关关系，与海拔正相关系数最高为（0.440）；与经度、纬度之间呈负相关关系，与经度负相关系数最高为（–0.419）。哈巴俄苷与经度、纬度呈正相关，与海拔、降雨量、年平均温度呈负相关，与海拔负相关系数最高为（–0.360）。

表5 玄参中哈巴苷、哈巴俄苷含有量与生境因子相关性分析

2.3 聚类分析

以哈巴苷、哈巴俄苷含量以及两者总量为参考指标，对15 个产地玄参进行聚类分析，根据欧式距离D2=19.98 将不同产地划分为3 个类群，如图2所示。类群I 共5 个产地，分别为浙江临安，河南南丰，贵州阳溪、玉溪，四川陇东，该类玄参中哈巴苷含量、哈巴苷和哈巴俄苷总量最高；类群II 有8 个产地、分别为贵州洛龙，四川五龙，安徽利辛、谯城区、涡阳，浙江磐安，河南太丘、朱庄，这些产地哈巴俄苷含量次之；类群III 共有2 个产地，分别是四川永富和杭州植物园，这两个产地的哈巴俄苷含量、哈巴苷和哈巴俄苷总量最低。

图2 15 批玄参样品聚类树状图

3 讨论与结论

本试验采用高效液相法测定玄参哈巴苷与哈巴俄苷含量，经PDA 检测器对哈巴苷和哈巴俄苷标准品溶液进行波长扫描，结果显示，哈巴苷的最大检测波长是210 nm，与溶剂甲醇的吸收波长一致，此处会有溶剂峰的出现，而哈巴俄苷的最大检测波长是280 nm，此时基线平稳，未与溶剂峰相重叠，因此，确定检测波长为210 nm 和280 nm；采用2020 版《中国药典》中哈巴苷与哈巴俄苷的含量测定的提取方法及流动相，结果显示，提取、分离效果良好，哈巴苷与哈巴俄苷在甲醇中超声处理45 min即可提取完全，各峰之间的分离度>1.5，理论塔板数>5 000，哈巴苷与哈巴俄苷的保留时间分别是10.107、24.116 min。

药用植物的生长环境对次生代谢产物的积累起着非常关键的作用，包括经纬度、海拔、降雨量等[14]。本实验结果显示，15 个产地玄参根中哈巴苷、哈巴俄苷的含量存在统计学差异（P<0.01），其中四川陇东、河南南丰、浙江临安、磐安含量最高；海拔、降雨量、年平均温度与哈巴苷之间呈正相关，与哈巴俄苷呈负相关。课题组发现，浙江临安、磐安的海拔分别是1 050 m、1 020 m，远高于杭州植物园的25 m，因此，临安、磐安哈巴苷的含量要高于植物园，这与实验结果一致；经纬度与哈巴俄苷呈正相关，且相关系数较大，经纬度越高，哈巴俄苷的含量就越大，四川陇东、永富、五龙的经纬度低于安徽利辛、涡阳、谯城区，因此，前者的哈巴俄苷的含量低于后者。结果显示，经纬度越高越有利于哈巴俄苷的积累，降雨量越大，海拔越高，越有利于哈巴苷的积累，故可优先在拥有上述环境条件的种质中选择。本实验只对玄参中哈巴苷、哈巴俄苷的含量进行测定，下一步将继续增加其他活性成分的含量测定，为玄参的质量控制提供参考依据。