基于PERK/ Nrf2 通路探讨复方芪鹰颗粒治疗糖尿病周围神经病变的机制

陈 臣 胡 燕 刘 涛 胡晓灵

1.新疆医科大学第四临床医学院，新疆乌鲁木齐 830011；2.新疆维吾尔自治区中医医院，新疆乌鲁木齐 830000

糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病最常见、最复杂的并发症之一，发病率达50%[1]。临床上DPN 常累及患者的感觉和运动神经，产生肢体麻木、疼痛等感觉障碍，甚至导致肌肉无力及萎缩，严重影响患者的生存质量[2-3]，威胁患者的生命安全[4-5]。在治疗方面，由于病因不明，目前西药仅对症治疗且只有短期效果[6-7]，与中医药效果比较仍显不足[8]。复方芪鹰颗粒是全国名中医胡晓灵的经验方，亦为新疆维吾尔自治区中医医院院内制剂，前期临床研究发现，该方能有效改善运动正中神经、感觉正中神经、感觉腓总神经传导速度，还具有升高血管内皮生长因子及胰岛素样生长因子-1 的作用，临床有效率达87.9%[9-10]。蛋白激酶RNA 样内质网激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）介导的C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）途径是内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）诱导细胞凋亡主要途径之一，抑制PERK 介导的核转录因子红系2 相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）核转位/转录激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）/CHOP途径能够减轻细胞凋亡[11]。目前研究发现，PERK/Nrf2通路在DPN 中发挥重要作用[12]。因此，本研究拟从PERK/Nrf2 通路为切入点，探讨复方芪鹰颗粒治疗DPN 的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药物

72 只雄性8 周龄SPF 级Wistar 大鼠，体重180～220 g，购于新疆医科大学动物中心[动物许可证号：SCXK（新）2018-0002]。复方芪鹰颗粒购于新疆维吾尔自治区中医医院（ZJ2012006），7.5 g/袋；三甲胺N-氧化物，购于Sigma，货号为317594-1G。本研究经新疆医科大学实验动物伦理委员会审批（IACUC20200930-9）。

1.2 主要试剂与仪器

链脲菌素（Streptozotocin，STZ）（美国Sigma，S0130-1G）、苏木精染液（福州迈新生物技术开发有限公司，CTS-1097）、伊红染液（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9613）、GRP78（美国CST，3183S）、p-PERK（美国CST，3179S）、PERK（CST，3192S）、Nrf2（美国abcam，Ab89443）、ATF4（美国CST，11815S）、胱天蛋白酶-3（cysteine aspartic acid specific protease-3，caspase-3）（美国abcam，Ab184787）、CHOP（美国CST，2895S）、二抗山羊抗兔IgG H&L（美国abcam，Ab205718）、二抗山羊抗小鼠IgG H&L（美国abcam，Ab205719）、流式细胞仪（美国BD，LSRFortessa）、蛋白转膜仪（美国Bio-Rad，Mini-PROTEAN Tetra system）、血糖仪（瑞士罗氏Accu-Chek，卓越型）。

1.3 DPN 大鼠模型构建

造模参照课题组前期研究[13-14]，造模大鼠持续喂45%高脂饲料（江苏协同医药生物工程有限公司，XTHF45-1）8 周后，注射小剂量链脲佐菌素30 mg/kg造糖尿病模型。选取空腹血糖＞11.1 mol/L 的大鼠作为糖尿病模型大鼠继续高脂饮食4 周后，用Meditronic keypoint-4 workstation 肌电图仪评估DPN 造模情况，以下肢坐骨神经感觉或运动传导速度减慢≥11%为造模成功。

1.4 分组与给药

将实验动物采用计算机随机数字法分为正常对照组、模型组、阳性药组及复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组，每组12 只。模型组、阳性药组及复方芪鹰颗粒低、中、高组构建DPN 大鼠模型，造模成功后复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组分别予以复方芪鹰颗粒1.17、2.34、4.68 g/kg[14]，阳性药组予以氧化三甲胺110 mg/kg，2 ml/次，灌胃1 次/d，模型组及正常对照组给予等量的双蒸水。干预时间为4 周，期间各组自由进食和水。

1.5 血糖测定及苏木精-伊红染色

在DPN 造模成功后及药物干预4 周后，取大鼠尾部血，用Accu-Chek 血糖仪测血糖。在末次给药后，所有大鼠禁食12 h，用3%戊巴比妥钠（50 mg/kg）充分麻醉，俯卧位固定于手术台上，手术留取坐骨神经标本[15]，并将组织一部分置于10%福尔马林溶液，一部分置于冻存管内，液氮速冻后于-80℃冻存备用。将10%福尔马林溶液中坐骨神经标本固定1 周后，进行石蜡包埋，最后切制成约5 μm 切片。按照苏木精-伊红染色试剂盒上说明进行操作，分别在40、100、200及400 倍显微镜下观察大鼠坐骨神经病理学改变。

1.6 蛋白质印迹法检测相关蛋白

根据课题组前期实验方法[15]对各组坐骨神经组织进行蛋白质印迹法检测。一抗孵育：GRP78（1∶1 000稀释）、PERK（1∶800 稀释）、p-PERK（1∶600 稀释）、ATF4（1∶800 稀释）、Nrf2（1∶800 稀释）、CHOP（1∶800稀释）、caspase-3（1∶1 000 稀释）、β-actin（1∶1 000稀释）。二抗兔抗（R）1∶5 000 稀释，鼠抗（M）1∶15 000稀释。采用ChemiScope mini 化学发光仪检测、拍照，用Image Lab 图像分析。

1.7 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，两组比较采用t 检验。多组计量资料比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

整个实验过程中，最终完成实验动物为46 只，其中正常对照组12 只、模型组6 只、复方芪鹰颗粒低剂量组6 只、复方芪鹰颗粒中剂量组6 只、复方芪鹰颗粒高剂量组8 只、阳性对照组8 只。

2.1 六组坐骨神经苏木精-伊红染色

镜下观察可见，正常对照组有髓神经纤维结构完整、分布均匀、排列规则，轴索、髓鞘及神经膜形态结构良好、完整，神经内膜形态结构正常；模型组有髓神经纤维脱失、减少，部分排列紊乱，部分轴索变性，节段性脱髓鞘，神经膜增厚，神经内膜胶原纤维增生；与模型组比较，复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组髓神经纤维轴索变性、脱髓鞘、神经膜增厚及神经内膜增生程度均减轻。见图1。

图1 六组坐骨神经苏木精-伊红染色

2.2 六组DPN 造模成功后及药物干预4 周后血糖水平比较

DPN 造模成功后，模型组血糖高于正常对照组（P＜0.05），复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组血糖与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。药物干预4周后，模型组血糖高于正常对照组，复方芪鹰颗粒低、中、高剂量组血糖低于模型组，复方芪鹰颗粒中、高剂量组血糖低于复方芪鹰颗粒低剂量组（P＜0.05）。见表1。

表1 六组DPN 造模成功后及药物干预4 周后血糖水平比较（mmol/L，）

表1 六组DPN 造模成功后及药物干预4 周后血糖水平比较（mmol/L，）

注 与正常对照组同期比较，aP＜0.05；与模型组同期比较，bP＜0.05；与复方芪鹰颗粒低剂量组同期比较，cP＜0.05。DPN：糖尿病周围神经病变。

2.3 六组坐骨神经GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、Nrf2、CHOP、caspase-3 表达比较

模型组坐骨神经组织GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP、caspase-3 高于正常对照组，Nrf2 低于正常对照组（P＜0.05）。复方芪鹰颗粒中、高剂量组GRP78、ATF4、CHOP 低于模型组，Nrf2 高于模型组；复方芪鹰颗粒高剂量组p-PERK、caspase-3 低于模型组（P＜0.05）。复方芪鹰颗粒高剂量组ATF4、CHOP 低于复方芪鹰颗粒低剂量组，复方芪鹰颗粒中剂量组CHOP 低于复方芪鹰颗粒低剂量组（P＜0.05）。见图2、表2。

图2 六组坐骨神经GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、Nrf2、CHOP、caspase-3 表达条带图

表2 六组坐骨神经GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、Nrf2、CHOP、caspase-3 表达比较（mmol/L，）

表2 六组坐骨神经GRP78、PERK、p-PERK、ATF4、Nrf2、CHOP、caspase-3 表达比较（mmol/L，）

注 与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与复方芪鹰颗粒低剂量组比较，cP＜0.05。GRP78：葡萄糖调节蛋白78；PERK：蛋白激酶RNA 样内质网激酶；p：磷酸化；ATF4：转录激活因子4；Nrf2：核转录因子红系2 相关因子2；CHOP：C/EBP 同源蛋白；caspase-3：胱天蛋白酶-3。

3 讨论

中医药在改善DPN 患者的血糖、临床症状及生活质量方面有着重要的作用[16-23]，复方芪鹰颗粒是胡晓灵主任医师经验方，应用于糖尿病周围神经病变治疗效果显著[14，24]。DPN 既有消渴，又有痿痹，以气阴亏虚为主证，兼以痰瘀阻滞、风伏络瘀。本方取黄芪为君药，而臣以黄精、鹰嘴豆，佐以丹参、蝉蜕，共成益气养阴、祛瘀化痰、疏风通络之制，实为治疗消渴痿痹之良剂。同时，消渴痿痹病机特点为气阴两虚，痰浊瘀血阻滞，风伏络脉，本方气、血、风药俱备，尤侧重于治气，独无祛痰药，但补气即可以祛痰，而祛瘀、活血、疏风，又使痰浊失却合邪之停留，自能令痰浊消除，这正是本方配伍精当简约之处。

目前研究发现，ERS 是DPN 发病的重要病理机制，亦是治疗该病的全新药物靶点[25-27]。以此为线索，前期本课题组进行了初步动物实验探索发现，复方芪鹰颗粒能够提高外周神经中内质网分子伴侣免疫球蛋白重链结合蛋白质同源的Hsp70 表达水平，减少神经受损程度[14]。该药可能提高了分子伴侣蛋白的表达，减少未折叠蛋白数量，参与了内质网应激过程。据此，本研究以ERS 相关的PERK/Nrf2 通路为切入点，探讨复方芪鹰颗粒治疗DPN 的分子机制。在PERK/CHOP 通路介导的DPN 凋亡研究中，ERS 参与DPN过程并诱导了外周神经的凋亡[28]。在DPN 的体内外ERS 实验研究中，促凋亡蛋白CHOP 和抑制凋亡蛋白ORP150 存在密切联系，且CHOP/ORP150 比值在DNP 病情的不同阶段起着不同的作用[27]。在基于ERS 的中药复方治疗DPN 的研究中，糖络宁汤剂治疗效果明显优于对照组，其作用机制是该方介导了ERS 中PERK/Nrf2 及PERK/CHOP/caspase-12 通路发挥抗凋亡的作用[12，29]。PERK/Nrf2 通路是ERS 的主要通路，且在防止施万细胞凋亡方面发挥重要作用[30]。本研究结果显示，复方芪鹰颗粒干预后大鼠坐骨神经观察到髓神经纤维轴索变性、脱髓鞘、神经膜增厚及神经内膜增生程度均减轻，血糖降低，坐骨神经中GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP、caspase-3 表达水平有显著下调，Nrf2 表达水平上调。

综上所述，复方芪鹰颗粒对DPN 大鼠的神经保护及降糖作用机制可能是该药抑制了PERK/Nrf2 通路，减轻了ERS，防止了大鼠坐骨神经有髓神经纤维轴索变性、脱髓鞘、神经膜增厚及神经内膜增生程度。该研究丰富了复方芪鹰颗粒药效学内容，为今后研究DNP 的防治奠定一定的理论基础，也为DPN 治疗提供一种可选药物。