基于网络药理学分析益气活血化痰方抗动脉粥样硬化的作用机制

2023-10-23 13:44孙琳洁俞佳利李屹龙薛金贵
中西医结合心脑血管病杂志 2023年19期
关键词:蛋白激酶水蛭益气

孙琳洁,陈 昕,俞佳利,李屹龙,薛金贵

心血管疾病是当前严重危害人类健康的疾病之一。动脉粥样硬化(AS)主要累及大、中动脉,导致脂质沉积、内膜纤维化,同时粥样斑块引起管壁变硬、管腔狭窄,导致心血管不良事件的发生,其发生发展是多个危险因素共同作用的结果,目前认为其主要与炎症反应、血脂代谢异常及内皮细胞损伤等因素有关[1-2]。益气活血化痰方由黄芪、丹参、全瓜蒌、水蛭、黄连组成,具有抑制炎症反应、调节血脂代谢、稳定粥样斑块等功效,从而降低心血管不良事件的发生风险[3-8]。本研究利用网络药理学的方法,对益气活血化痰方进行分析,探讨其抗AS的可能机制。

1 资料与方法

1.1 收集益气活血化痰方活性成分及相关靶点

基于中药系统药理学数据库分析平台(https://www.tcmsp.e.com/,TCMSP)筛选益气活血化痰方的有效成分,其中黄芪、丹参、全瓜蒌、黄连以口服生物利用度(OB)>30%、类药性(DL)>0.18为条件筛选有效成分。同时,收集文献资料整理水蛭的化学成分,并通过检索有机小分子生物活性数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/,PubChem)获得各成分的化学结构,其中未被PubChem平台收录的成分则利用ChemDraw软件绘制其化学结构,最终将所有化学结构的sdf格式文件上传至瑞士毒药物动力学数据库(http://www.swissadme.ch/,SwissADME)获取活性成分。筛选条件:胃肠道吸收力(GI absorption)为High,类药效(Druglikeness)的Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 5种规则中至少符合2项。在PubChem数据库中,物种选择“homo sapiens”,获取益气活血化痰方中有效成分的简化分子线性输入规范(SMILES),并导入瑞士靶点预测数据库(http://swisstargetsprediction.ch/,Swiss targets Prediction),以“probability>0”为条件获取所有潜在靶点。

1.2 获取AS靶点与筛选共同靶点

在基因名片数据库(https://www.genecards.org/,GeneCard)中获取AS基因,根据相关度(relevance score)进行由大到小的排序,以第三四分位数为条件进行筛选获得基因靶点,通过韦恩Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制韦恩图,获得益气活血化痰方与AS的共同靶点。

1.3 构建药物-疾病靶点蛋白质互作(PPI)网络图

将益气活血化痰方与AS的共同靶点导入功能性蛋白关联网络数据库(http://string-db.org,STRING) ,在“homo sapiens”背景下获取tsv文件,导入Cytoscape 3.9.1,使用Analyze Network工具进行拓扑分析,以拓扑学参数度值(Degree)≥第三四分位数为条件筛选获得关键靶点。

1.4 富集分析

在David数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中对关键靶点进行基因本体(GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,选择物种为homo sapiens,以P<0.01为条件将富集基因数由大到小排序,获得排名前20位的生物通路。利用微生信平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)将数据进行可视化分析,绘制柱形图和气泡图。

1.5 构建“活性成分-核心靶点-信号通路”网络

筛选出KEGG富集分析中富集基因数排名前20位的通路,找出富集在这些通路上的潜在靶点,并汇总与靶点相对应的药物活性成分。以活性成分、靶点、通路为节点,导入Cytoscape 3.9.1软件,构建益气活血化痰方治疗AS的成分-靶点-通路网络图。

2 结 果

2.1 益气活血化痰方活性成分及相关靶点

共获得益气活血化痰方的有效成分为:丹参65个,瓜蒌11个,黄连14个,黄芪20个,并根据相关文献报道收集水蛭化学成分68个[9-16],建立了水蛭化学成分数据库,最终获得有效成分36个(见表1)。将有效成分导入Swiss targets Prediction数据库并获得相关靶点,删除重复值后获得益气活血化痰方的有效靶点1 004个。

表1 水蛭活性成分基本信息

2.2 AS靶点与益气活血化痰方药物共同靶点

从GeneCard数据库提取AS靶点1 191个,利用Venny 2.1平台获取疾病与益气活血化痰方靶点交集,获得265个共同靶点。详见图1。

图1 药物-疾病靶点韦恩图

2.3 药物-疾病靶点PPI网络图

在STRING数据库上传共同靶点,采用Cytoscape 3.9.1软件对结果进行可视化,获得PPI网络,PPI网络共有263个节点、4 428条边。详见图2。节点大小和颜色深浅代表Degree值的大小,节点越大、颜色越深则Degree值越大,表明联系越紧密。以“Degree值≥第三四分位数”为条件筛选,获得关键靶点36个。详见图3。

图2 益气活血化痰方治疗AS的共同靶点PPI网络图

图3 益气活血化痰方治疗AS的关键靶点PPI网络图

2.4 GO与KEGG富集分析

使用David数据库对关键靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析,利用微生信平台将富集数据可视化。GO富集分析由生物过程(biological process,BP)、细胞组分(celluar component,CC)、分子功能(molecular function,MF)3部分组成。以基因数量(Count)值为纵坐标、富集条目为横坐标汇制GO富集三合一柱状图(见图4),可见在益气活血化痰方抗AS机制中,BP主要包括RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、基因表达的正向调控、转录的正调控和DNA模板、凋亡过程的正向调控等;CC主要包括核、质膜、细胞质、胞浆等;MF主要包括蛋白质结合、相同的蛋白质结合、酶结合、转录因子结合等。

图4 关键靶点GO富集分析

KEGG通路分析获得122条通路,选取基因富集数较小的20条通路,绘制气泡图(见图5),横坐标代表基因所占百分比,纵坐标代表基因通路,气泡尺寸代表基因数,气泡颜色代表富集倍数,气泡越大则表示通路作用越显著。可见,益气活血化痰方抗AS的主要通路包括癌症的通路、脂质和AS、糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物及其受体(AGE-RAGE)信号通路在糖尿病并发症中的应用、卡波西肉瘤相关性疱疹病毒感染、蛋白质聚糖在癌症中的应用等。

图5 关键靶点的KEGG通路富集气泡图

2.5 “活性成分-关键靶点-信号通路”网络

选取相关活性成分93个、关键靶点36个和前20条潜在通路,将数据导入Cytoscape 3.9.1绘制成分-靶点-通路相互作用的网络图(见图6)。网络图包含146个节点、645条边线。

3 讨 论

AS属中医“脉痹”“血痹”范畴,其病机为本虚标实,瘀血、痰浊、气滞为标,脏腑虚损为本。益气活血化痰方由黄芪、丹参、全瓜蒌、水蛭、黄连组成,方中黄芪益气养心,其性温,味微甘,能补气,兼能升气,善治胸中大气;丹参活血化瘀、养心通络;水蛭破血逐瘀,其味咸、色黑、气腐、性平,为其味咸,故善入血分,为其原为噬血之物,故善破血,为其气腐,其气味与瘀血相感召,不与新血相感召,故破瘀血而不伤新血;黄连能够清热燥湿、泻火解毒,防止久瘀化热;全瓜蒌涤痰散结、宽胸开郁。另外,气虚容易导致血瘀,血瘀容易导致气滞,气行推动血行,则瘀血得治。

益气活血化痰方可影响各种炎症信号通路发挥抗炎作用,对靶蛋白具有调节作用,同时能够调节脂质代谢、稳定粥样斑块、改善血管内皮功能、抗氧化[17-18]。黄芪还可提高胰岛素敏感性,保护心脑血管,抑制心脏重构,保护心肌,促进心肌梗死后的血管重建,改善能量代谢,抑制细胞凋亡[19-21]。丹参的药理作用还包括抗肿瘤[22]、抑制心肌肥大[23]等。全瓜蒌具有扩张冠状动脉、抗血小板凝集、保护心肌的作用[24]。水蛭在抗血小板凝集、抗凝方面也有显著的作用[15]。

本研究运用网络药理学,获得益气活血化痰方与AS的共同靶点,构建PPI网络,筛选出关键靶点,其中,蛋白激酶 B1(AKT1)、禽肉瘤病毒17假定转化基因(JUN)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、p38丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、核因子Kappa Bp65(RELA)、肿瘤坏死因子(TNF)等在益气活血化痰方抗AS过程中尤为重要。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)可将信号从细胞表面传导至细胞核内部[25]。MAPK3/1即细胞外信号调节激酶(ERK1/2),与肿瘤的发生密切相关[26-27];ERK通路的激活与炎症反应也密切相关[23]。MAPK14在细胞转录调节、细胞骨架识别及细胞凋亡中发挥重要作用,该关键靶点的激活能够促进炎性细胞因子的产生[28-29]。研究表明,MAPK通路抑制剂特异性地抑制多种炎性因子的产生,从而显著阻断炎症反应的发生[23,28-29]。TNF具有造血、抗感染、免疫监视和抗肿瘤等作用,可通过与肿瘤坏死因子受体1型(TNFR1)结合,激活核因子 Kappa B(NF-κB)、MAPK以及c-Jun通路,促进白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等促炎性细胞因子的表达,介导炎症反应[30-32]。另外,在NF-κB炎症通路介导的免疫应答过程中,RELA基因调控也发挥重要的作用[33]。同时,TNF与肿瘤坏死因子受体2型(TNFR2)结合,激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT) 通路,AKT1又是PI3K/AKT通路的重要组成,AKT1参与调节内皮型一氧化氮合酶(eNOS)及一氧化氮(NO)生成,增加AS斑块的不稳定性,其水平的升高与AS的发生发展密切相关[34-35]。PI3K/AKT通路及下游信号分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)可以影响AS中巨噬细胞脂质代谢、极化分型、自噬等过程,影响AS的疾病进程[36-37]。研究发现,Janus激酶2/信号转导与转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路能够通过介导炎性因子促进动脉内膜增厚,增加抗炎性因子,以促进动脉斑块的消退[38-39]。STAT3信号转导促进血管平滑肌细胞增殖迁移,诱导新生内皮及血管的形成,促进AS的进展,因此,抑制IL-6/STAT3通路能够降低心血管疾病的风险[40-41]。CXCL8参与炎症反应的发生[42],MMPs中的基质金属蛋白酶-9(MMP9)能够促进细胞外基质降解以及血管平滑肌细胞的迁移[43-44]。CXCL8可以显著提高基质金属蛋白酶(MMPs)的活性,同时MMPs通过蛋白水解效应增加CXCL8的生物学活性,CXCL8与基质金属蛋白酶(MMPs)两者相互影响,共同导致AS不断进展和恶化[45-46]。非受体酪氨酸激酶(SRC)是由多种细胞外信号分子激活的蛋白激酶,SRC在各种细胞因子诱导下,通过激活ERK1/2、p38/MAPK、PI3K/AKT等信号转导通路,诱导细胞增殖,导致内皮功能紊乱,促进血管内皮细胞的增殖和迁移[47-49]。同时,促进脂多糖(LPS)介导的巨噬细胞的迁移以及炎症反应,诱导巨噬细胞合成和分泌炎性因子,导致AS进展[50]。

上述相关研究涉及此次网络药理学所预测的关键靶点,表明益气活血化痰方对AS具有一定的疗效,该过程中,炎性因子的表达以及炎症反应的发生、血管内皮细胞的增殖和迁移发挥了关键作用;其次,通过KEGG富集分析结果可知,药物-疾病之间的潜在通路中,与AS密切相关的主要是脂质和AS通路。

本研究通过网络药理学,对益气活血化痰方治疗AS的作用机制进行了初步分析,发现其具有多成分、多靶点和多通路的特点,为AS的治疗提供了研究思路和理论基础。然而,网络药理学对于中药作用研究的复杂性具有局限性,还需要通过更多深入的研究来验证这些理论,提供更加有力的科学依据。

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