丹皮酚对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤的缓解作用

杨明，李可，贾丽，武英豪，林倩颖，袁丽宁，李连敏，马玉忠

(河北农业大学动物医学院，河北 保定 071001)

奶牛乳房炎会导致奶牛产奶量下降，饲养成本增加及奶牛淘汰率上升，严重影响奶牛养殖产业的发展。有研究表明，奶牛乳房炎主要由病原微生物侵入乳房组织引起[1]，这些病原微生物的种类可达150多种，其中主要致病菌为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌[2]。LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分之一，是导致体内外炎症反应的重要刺激因素，临床上常用来建立各种炎性模型[3]。LPS能与细胞表面的TLR4样受体结合，激活NF-κB信号通路，促进IL-1β、IL-6、IL-8等炎性因子的表达和释放，促进炎症的发展[4-5]。在国内，抗生素仍是预防和治疗奶牛乳房炎的主要方法，但随着抗生素的大量使用导致耐药菌株出现以及药物残留的问题日益凸显，给人类及动物健康造成了严重威胁。因此寻找抗生素的替代药物，已成为当下发展的必然趋势[6]。丹皮酚是牡丹根茎的提取物，具有良好的抗炎、神经保护、抗氧化应激、抗肿瘤、预防心血管疾病的作用[7]，因其具有无毒，低残留的特点，在治疗奶牛乳房炎方面具有巨大的应用潜力[8]。目前，丹皮酚对奶牛乳房炎的治疗作用及机理尚不明确，本研究利用LPS建立奶牛乳房炎体外炎症模型，探讨丹皮酚对细胞炎性反应的潜在作用，为后续临床治疗奶牛乳房炎奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

丹皮酚购自大连美仑生物技术有限公司；LPS购自Gentihold公司；DMSO、CCK-8试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、BCIP/NBT底物显色试剂盒、RIPA高效裂解液、DAPI染色液均购自Solarbio公司；牛TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA试剂盒购自上海酶联生物有限公司；DMEM/F12培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份公司；胰蛋白酶购自Amresco公司；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自北京康为公司；IкBα抗体购自Cell Signaling Technology公司；p-IкBα、p-p65、p65、β-actin抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；2× Fast Super EvaGreen qPCR Mastermix购自US Everbright公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天公司。

1.2 细胞活力检测

试验分为空白对照组、0加药组、丹皮酚处理组(10、20、50、80、100 mg/L)，每组设3个孔。空白对照组不添加细胞，丹皮酚处理组将细胞按1×104个/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后加入不同浓度的丹皮酚，于37 ℃、5% CO2条件下孵育12 h，使用CCK-8试剂盒检测细胞活力。计算公式如下：

细胞活力=[A(加药)-A(空白)]/[A(0 加药)-A(空白)]×100%，A表示吸光度。

1.3 试验分组及处理

将奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基于37 ℃、5% CO2条件下孵育12 h。进行如下处理。

空白对照组(Con)：用无血清培养基培养24 h后继续用无血清培养基培养12 h。

LPS组：用含20 mg/L LPS 的无血清培养基孵育24 h后继续用无血清培养基培养12 h。

LPS+(低、中、高)丹皮酚处理组：用含20 mg/L LPS的无血清培养基孵育24 h后，换含20、50、100 mg/L丹皮酚的无血清培养基培养12 h，3个组别分别命名为Low、Mid和Hig。

1.4 荧光定量PCR(RG-qPCR)

将培养好的BMECs 用PBS清洗3次，使用超纯RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，用NanoDrop2000检测RNA的浓度和纯度。随后用逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA，进行RT-qPCR反应，采用2-ΔΔCt计算目的基因的mRNA表达情况，通过标准曲线分析法来确定RT-qPCR的扩增效率。

反应程序为：预变性，95 ℃ 300 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45个循环。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 氧化应激指标检测

将BMECs用PBS清洗3次，每孔内加入适量RIPA裂解液，待细胞裂解充分后，12 000 r/min，离心5 min，取上清液。使用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测细胞蛋白浓度，并使用试剂盒测定细胞氧化应激因子的含量。

1.6 细胞凋亡检测

将培养好的BMECs用PBS清洗1次，根据Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明对细胞进行染色，随后于荧光倒置显微镜下观察。

1.7 Western blot

配置浓缩胶、分离胶进行SDS凝胶电泳检测，半干法转膜，脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗膜，一抗4 ℃过夜，TBST洗膜，二抗常温孵育1 h，TBST洗膜，BCIP/NBT试剂盒显色。IκBα、p-IκBα抗体稀释倍数为1∶1 000，p65、p-p65、β-actin抗体稀释倍数为1∶2 000。

1.8 统计与分析

试验数据使用SPSS 19.0进行 One-way ANOVA分析，使用GrarhPad Prism 8.0绘制图表，结果用“平均值±标准差”表示。差异显著性判断以P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 丹皮酚对BMECs活力的影响

由图1可知，10～100 mg/L的丹皮酚处理BMECs后，各剂量组细胞活力均有上升，但差异不显著 (P>0.05)。本试验选取对细胞活力无显著影响的20、50、100 mg/L的丹皮酚作为后续低、中、高处理剂量。

图1 不同浓度丹皮酚处理BMECs后的细胞活力

2.2 丹皮酚对 IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达的影响

如图2所示，与对照组相比，LPS组IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)；与LPS组相比，丹皮酚低、中、高剂量的IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA相对表达量均显著降低(P<0.05)。

同一指标中不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)；下同

2.3 丹皮酚对SOD、MDA、GSH-Px活性及含量的影响

由图3A可知，与对照组相比，LPS组SOD活性显著降低(P<0.05)，而中剂量和高剂量的丹皮酚能显著升高SOD活性(P<0.05)。由图3B可知，与对照组相比，LPS组MDA含量显著升高(P<0.05)，而高剂量的丹皮酚能显著抑制MDA含量的升高(P<0.05)；由图3C可知，与对照组相比，LPS组GSH-Px活性显著降低(P<0.05)；丹皮酚高剂量组同LPS组相比GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。

图3 SOD、MDA、GSH-Px的活性及含量变化

2.4 丹皮酚对细胞凋亡的影响

由图4可知，LPS处理组相较于对照组凋亡细胞数量明显增多，而使用中剂量丹皮酚处理后抑制了LPS诱导的细胞凋亡。

A.凋亡细胞包含早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞；早期凋亡细胞仅发出绿色荧光(Annexin V-FITC阳性，PI阴性)，晚期凋亡细胞发出绿色和红色荧光(Annexin V-FITC阳性，PI阳性)，正常细胞无荧光(Annexin V-FITC阴性，PI阴性)；标尺=100 μm；B.各组阳性细胞数统计；数值来自于3个独立试验中的5个视野

2.5 丹皮酚对IκBα、p-IκBα、p65、p-p65蛋白表达的影响

与对照组相比，LPS组极显著提高了IκBα、p65蛋白的磷酸化水平(P<0.05)(图5B、5C)，而低、中、高剂量的丹皮酚均能显著抑制IκBα (图5B)、p65 (图5C)磷酸化水平的升高(P<0.05)。

图5 丹皮酚对BMECs中NF-κB信号通路的影响

3 讨论

抗生素对畜牧业发展作出了重大贡献[9]，但随着抗生素的大量应用，耐药菌株及药物残留问题愈发严重，引起人们对动物生产活动的担忧。因此寻找有效、绿色、低毒、易得、价廉的替抗药物迫在眉睫。目前，多种无抗治疗方法可用于防治奶牛乳房炎，如中药、细胞因子、乳酸菌、微生态制剂等[10]。丹皮酚作为一种中药提取物，具有多种药理作用，抗炎作用便是其中之一。研究表明，丹皮酚能抑制炎性细胞因子分泌，调节相关激酶及信号通路的活性，发挥抗炎作用[11]。季力同等[12]发现丹皮酚可以显著降低急性胰腺炎模型大鼠血清的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量，从而减轻急性胰腺炎造成的病理损伤。刘海涛[13]发现丹皮酚可以调节NF-κB信号通路，抑制LPS引起的奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤。Liu等[14]研究表明丹皮酚通过抑制IL-1β的分泌，从而发挥治疗大鼠骨关节炎的作用。Himaya等[15]研究表明丹皮酚能抑制NF-κB和MAPK信号通路，阻断LPS诱导的BV-2和RAW264.7细胞的炎症反应。因此推测，丹皮酚在治疗奶牛乳房炎方面同样具有良好的作用。

LPS作为一种具有代表性的促炎物质，可激活NF-κB信号通路，从而促进其下游炎症因子的产生，加重炎症的发展进程。Liu等[16]使用LPS成功建立了奶牛乳房炎体内外炎症模型。本试验使用20 mg/L的LPS处理BMECs后，IL-6、IL-1β、TNF-α含量显著升高，表明炎症模型成功建立。而经过丹皮酚处理后，IL-6、IL-1β、TNF-α含量有不同程度的下降，中、高剂量的丹皮酚能显著抑制细胞中IL-1β的表达，同时高剂量丹皮酚对细胞IL-6、TNF-α也有显著抑制作用，表明丹皮酚抑制细胞炎性因子的表达与作用剂量有一定的关系。LPS在刺激细胞炎性进展中，能使细胞产生氧化应激损伤，并诱导细胞凋亡的发生，同时产生多种复杂的生理作用[17-18]。

在乳房炎发展过程中，氧化应激对疾病的发展同样发挥重要的作用，SOD是生物体内抗氧化酶系的重要成员之一，可催化体内的超氧阴离子分解为氧和过氧化氢，从而减缓超氧阴离子对机体的损伤。MDA属于脂质过氧化物，它的含量可间接反映出机体细胞损伤的严重程度。GSH-Px是机体内重要的自由基捕获酶之一，不仅具有清除自由基和衍生物的作用，还减少脂质过氧化物的形成，增强机体抗氧化损伤的能力[19-21]。本研究发现，当LPS作用于BMECs后，细胞的SOD和GSH-Px的活性显著降低，MDA的含量显著升高，表明此时细胞的抗氧化能力下降并出现氧化应激损伤；而丹皮酚处理后可逆转这些变化，表明丹皮酚能提高细胞抗氧化能力，缓解细胞损伤，对治疗奶牛乳房炎具有积极的作用。细胞凋亡是机体主动地适应内环境变化的过程，与细胞炎性损伤过程密切相关。有研究表明，植物提取物对细胞凋亡有良好的调节作用。朱海泉等[22]研究发现，川芎嗪有抑制NF-κB p65磷酸化对LPS诱导的骨关节炎软骨细胞凋亡的作用。Akhtar等[23]发现，石榴果提取物对创伤性关节炎兔软骨细胞凋亡有良好的调节作用。本试验使用丹皮酚处理LPS炎性模型后，凋亡细胞数量明显减少，说明丹皮酚对细胞凋亡有一定的抑制作用。

NF-κB是细胞内重要的核转录因子，参与机体的炎症反应、免疫应答、细胞凋亡和应激等过程。NF-κB的过度激活，与人类许多疾病如类风湿关节炎、心脏与脑部疾病的炎症变化密切相关[24]。当LPS等促炎物质进入机体后，与细胞表面的TLR4结合，导致后者的构型的改变，进而使IκB磷酸化释放NF-κB p65。细胞质中游离的p65进入细胞核后发挥促炎等复杂生理功能[25]。本试验结果表明，当LPS作用于BMECs后，IκBα和p65的磷酸化水平升高，而不同剂量的丹皮酚降低了IκBα和p65的磷酸化水平。说明丹皮酚抑制了NF-κB信号通路的活性，抑制炎症反应，这与贾红豆[5]和刘逸煊等[26]的研究结果一致。综上所述，丹皮酚能抑制BMECs中NF-κB信号通路的活性和炎性基因的表达，缓解造成的炎性损伤，对治疗奶牛乳房炎具有良好的效果。由于体外细胞模型无法完全复制生物体复杂的内环境，丹皮酚在牛体上的治疗效果和作用机理仍需进一步研究。