表面增强拉曼光谱法快速检测咸鸭蛋中苏丹红

胡家勇，彭青枝，周陶鸿，林津，刘国娇

1.湖北省食品质量安全监督检验研究院（武汉 430075）；2.国家市场监管重点实验室（动物源性食品中重点化学危害物检测技术）（武汉 430075）；3.湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心（武汉 430075）

苏丹红为亲脂性的偶氮染料，对人体器官如肝肾等具有明显毒性，经常性食用含苏丹红的食品会导致器官发生癌变[1]。由于苏丹红增色效果明显并且价格比较低廉，苏丹红增色后的食品不仅颜色看上去鲜艳同时还不容易褪色，因此，某些不法的商贩为牟取利润将苏丹红偶氮染料添加到鸭子的饲料中，鸭子食用含苏丹红的饲料后，在体内代谢然后产出蛋黄呈现红色的鸭蛋，以此冒充红心鸭蛋。对于食品中苏丹红的检测方法包括HPLC法、HPLC-MS法、UPLC-MS/MS法等[2-7]。虽然色谱法是苏丹红检测的常用方法，但是色谱法存在一些缺陷，如检测周期长、无法实现现场检验等。开发一种快速高效且能实现现场快速检测食品中苏丹红的方法具有重要意义。

近年来，随着科研工作者对表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）技术研究的不断深入，SERS技术在食品质量安全快速检测方面的得到较为广泛的应用[8-13]，SERS技术因其可以实现实时、原位检测，而且具有灵敏度高、检测周期短等优点[14-15]，使得其已发展成食品中危害物快速检测的有力工具，但是由于微痕量检测中拉曼信号微弱会受到复杂体系中其它未知组分的干扰，使得表面增强拉曼光谱在微痕量危害物的检测中依然存在很大的挑战。分子印迹固相萃取是一种高效、高选择性的样品预处理技术，能够有效去除对目标物分析的干扰物质，并且能够富集痕量组分，提高分析灵敏度，使其成为表面增强拉曼光谱在微痕量危害物检测中较为理想的前处理技术。基于分子印迹固相萃取结合表面增强拉曼光谱在食品中微痕量危害物的检测也有相关报道，如Xiao等[16]利用印迹固相萃取结合表面增强拉曼光谱法快速分析猪组织中的莱克多巴胺。

试验建立一种基于MIPS-SERS技术快速定性检测咸鸭蛋中苏丹红的方法，以期为咸鸭蛋中苏丹红快速筛查提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准品（坛墨质检科技股份有限公司）；金纳米溶胶、苏丹红净化管[普拉瑞思科学仪器（苏州）有限公司]；Copure苏丹红分子印迹专用柱（深圳逗点生物技术有限公司）；乙腈、正己烷、乙酸乙酯、氯化钠（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

Alliance高效液相色谱仪（美国Waters公司）；inVia拉曼光谱仪（英国Renishaw公司）。

1.3 方法

1.3.1 样品的提取

准确称取1 g咸鸭蛋黄于15 mL离心管中，加入5 mL正己烷，涡旋1 min，超声5 min，按3 900 r/min离心5 min，收集上层清液，残渣重复提取4次，合并所有上清液，于40 ℃氮吹浓缩至约5 mL，此为提取液。

1.3.2 样品的净化

将提取液全部转移至苏丹红净化管中，振荡30 s，按3 900 r/min离心1 min，将上层清液加入苏丹红分子印迹柱（使用前用5 mL正己烷活化），加入5 mL正己烷淋洗，弃去流出液，加5 mL乙酸乙酯进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液于40 ℃氮吹至近干，用1 mL乙腈定容，涡旋1 min，此为待测液。

1.3.3 检测

吸取500 μL纳米金溶胶于检测瓶中，加入100 μL待测液，振摇混匀后加入100 μL 1%的氯化钠溶液，振摇混匀后上机进行检测。

1.3.4 拉曼光谱仪参数设定

拉曼光谱仪参数设定见表1。

表1 拉曼光谱仪参数

1.3.5 进样方式

试验所采用的检测仪器为显微共聚焦拉曼光谱仪，显微镜聚焦程度对仪器的检测结果影响很大，为避免每次检测时的反复聚焦，同时也为确保试验条件的统一，试验设计如图1所示的进样装置，此装置可确保显微镜聚焦程度的一致性和试验结果的重复性。试验采用拉杆式注射器抽吸的方式进样，待样品灌满测试管后开始检测。为避免残留干扰检测，在进行下一个样品的检测前需用拉杆注射器抽吸去离子水使其充满管路后推射至废液瓶中，如此重复3～5次。

图1 进样示意图

1.4 结果分析

使用拉曼光谱自带软件WiRE 5.0进行拉曼光谱采集以及拉曼光谱的预处理。用Excel软件对结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 苏丹红分子振动模式归属[16-19]

苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准溶液（质量浓度20 mg/L）表面增强拉曼光谱图如图2所示。可以看出苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准溶液的拉曼特征峰。苏丹红Ⅰ的特征峰有685，722，749，843，978，1 024，1 162，1 223，1 251，1 340，1 377，1 478，1 531，1 577和1 597 cm-1，其中：722 cm-1为苯环的C—H环外振动；749 cm-1对应于苯环的扭转振动、—OH基平面内的弯曲振动、C—O的伸缩振动；978 cm-1为苯氮的＝N-phenyl伸缩振动；843 cm-1为C—N键的伸缩振动；1 162，1 223和1 340 cm-1为环内变形，还伴随N—C拉伸振动、C—H面内摆动；1 377 cm-1为CH3-phenyl伸缩振动；1 597 cm-1为苯环骨架的伸缩振动。

苏丹红Ⅱ的特征峰有711，847，924，979，1 022，1 226，1 242，1 307，1 340，1 374，1 491和1 595 cm-1，其中：979 cm-1为苯氮的＝N-phenyl伸缩振动；1 022 cm-1是C—H面内摆动；1 242和1 491 cm-1为C＝C收缩振动，还伴随着C—H面内摆动、O—H面内摆动；1 374 cm-1为CH3-phenyl伸缩振动；1 226和1 340 cm-1为环内变形，还伴随N—C拉伸振动；1 595 cm-1为苯环骨架的伸缩振动。

苏丹红Ⅲ的特征峰有712，987，1 134，1 184，1 230，1 338，1 394，1 415，1 439，1 496和1 594 cm-1，其中：987 cm-1是萘环的呼吸振动；1 134，1 187和1 230 cm-1为C—H面内摆动，其中SERS最强峰1 134 cm-1为萘环的C—H和O—H的面内摆动；1 394，1 415，1 439，1 496和1 594 cm-1是N＝N面内的伸缩振动，还伴随苯环和部分C＝C伸缩振动[18]；1 594 cm-1为苯环骨架的伸缩振动。

苏丹红Ⅳ的特征峰有688，713，805，890，986，1 098，1 175，1 199，1 259，1 342，1 381，1 452，1 489和1 594 cm-1，其中：986 cm-1是萘环的呼吸振动；1 096，1 199和1 259 cm-1是C—H的面内摇摆；1 381 cm-1为CH3-phenyl伸缩振动；1 489 cm-1为C＝C收缩振动，还伴随着C—H面内摆动、O—H面内摆动；1 594 cm-1为苯环骨架的伸缩振动。

2.2 定性检测方法建立

2.2.1 定性检测

苏丹红Ⅰ～Ⅳ及试剂空白表面增强拉曼光谱图如图3所示。拉曼光谱谱图又被称为指纹图谱，具有不同化学结构的物质其对应的拉曼光谱图都不一样，根据拉曼光谱信号强度分为骨架特征峰和指纹特征峰，因骨架特征峰信号比较明显，因此选择苏丹红Ⅰ～Ⅳ强度较大的拉曼骨架峰作为它们的定性特征峰，苏丹红Ⅰ选择722，977，1 223，1 377，1 478和1 577 cm-1（一阶光谱峰中心位置重复性≤3 cm-1）作为其表面增强拉曼定性检测的特征峰，苏丹红Ⅱ选择711，979，1 226，1 374，1 491和1 595 cm-1（1阶光谱峰中心位置重复性≤3 cm-1）作为其表面增强拉曼定性检测的特征峰，苏丹红Ⅲ选择1 134，1 184，1 230，1 394，1 496和1 594 cm-1（一阶光谱峰中心位置重复性≤3 cm-1）作为其表面增强拉曼定性检测的特征峰，苏丹红Ⅳ选择986，1 098，1 175，1 259，1 381，1 452和1 594 cm-1（1阶光谱峰中心位置重复性≤3 cm-1）作为其表面增强拉曼定性检测的特征峰。

图3 苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准溶液表面增强拉曼光谱图

将待测的样品按1.3.1～1.3.2的方式进行前处理然后按1.3.3的方式进行检测，根据SERS谱图的拉曼峰位移，对咸鸭蛋中是否含有苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ进行定性判定：如果样品中同时存在苏丹红Ⅰ的定性特征峰，那么可以判定该样品含有苏丹红Ⅰ；否则，不能判定样品中是否含有苏丹红Ⅰ，需要进一步试验验证。苏丹红Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ同理定性评估。

2.3 MIPS-SERS检测体系的方法学评价

2.3.1 加标回收率

阳性模拟样品的制备及前处理：配制质量浓度为1，2和10倍检出限的苏丹红Ⅰ～Ⅳ标准品溶液（正己烷为溶剂），取适量标准溶液，添加到经食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法检测不含有苏丹红Ⅰ～Ⅳ的蛋黄中，充分混合后，静置过夜。将1 g阳性模拟样品和阴性实际样品按1.3.1～1.3.2进行提取净化，得到待测液。待测液经滤膜过滤后用高效液相色谱法测试（测试条件按照GB/T 19681—2005《食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法》[20]），结果如表2所示。苏丹红Ⅰ回收率82.4%～98.5%、精密度1.3%～3.7%，苏丹红Ⅱ回收率82.3%～97.3%、精密度3.4%～5.5%，苏丹红Ⅲ回收率83.8%～97.3%、精密度4.5%～6.5%，苏丹红Ⅳ回收率82.9%～95.6%、精密度3.0%～6.1%。加标样品的测试结果表明分子印迹固相萃取法可用于咸鸭蛋中苏丹红Ⅰ～Ⅳ的前处理。

表2 阳性模拟样品中苏丹红加标的回收率

2.3.2 最低检出浓度

对含不同浓度苏丹红的咸鸭蛋蛋黄阳性模拟样品进行提取净化后用拉曼光谱仪检测，得到表面增强拉曼光谱图，如图4所示。随着苏丹红浓度的降低，其特征拉曼骨架峰强度信号也随着降低，苏丹红Ⅰ浓度低至0.5 mg/kg时，其特征峰拉曼信号极其微弱，但苏丹红Ⅰ浓度为1 mg/kg时，其特征峰拉曼信号还较为明显，因此试验方法确定苏丹红Ⅰ的最低检出浓度为1 mg/kg。同理，苏丹红Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的最低检出浓度分别为1，0.5和0.5 mg/kg。

图4 不同含量苏丹红染料模拟阳性样品的拉曼图谱

2.3.3 方法特异性考察

选取经国标方法筛选出来的阴性样本，加入1/2，1和2倍检出限浓度的标准溶液，按照1.3.1～1.3.2对加标样品进行提取净化，根据1.3.3～1.3.4对待测液进行上机检测，检测结果见表3。对于阴性样品，检测结果全为阴性，特异性均为100%，假阳性率均为0；对于阳性样品，检测结果全为阳性（+），灵敏度为100%，假阴性率为0，相对准确度为100%。

表3 特异性考察结果

2.4 实际样品SERS检测与HPLC方法的比对

试验选取经国标方法筛选出来的阴性样本25个批次，随机选取其中20个样品进行模拟阳性样本的制作，苏丹红Ⅰ～Ⅳ模拟阳性样品各5个，含量为10 mg/kg，随机编号为1～25，按照1.3.1～1.3.2对25批次样品进行提取净化，根据1.3.3～1.3.4对待测液进行上机检测，检测结果见表4。SERS法定性检测的阴阳性与HPLC法定量检测结果相一致。

表4 实际阴性样品及模拟阳性样品中苏丹红Ⅰ～Ⅳ的测定

2.5 SERS检测干扰因素分析

由于微痕量检测中会出现拉曼光谱信噪比低、微弱信号被荧光背景淹没、复杂体系中其他未知组分的干扰等因素的影响，SERS信号自动识别存在很大挑战。为最大程度提高SERS的灵敏度、提高SERS检测的检出能力，试验采用分子印迹固相萃取柱对样品进行净化，因分子印迹固相萃取具有很强的特异性，该前处理方法可很好地消除未知组分的干扰。此外，该定性方法选择苏丹红Ⅰ～Ⅳ的多个骨架特征峰作为其定性特征峰，确保定性准确。

3 结论

基于表面增强拉曼光谱技术，建立咸鸭蛋中苏丹红Ⅰ～Ⅳ快速定性检测的方法。该方法具有高灵敏度、强特异性、检测周期短、可满足现场检测等优点，适用于大批量的样品的靶向筛查。该方法苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的最低检测限分别为1，1，0.5和0.5 mg/kg。建立SERS法定性检测咸鸭蛋中苏丹红Ⅰ～Ⅳ，以期为咸鸭蛋中苏丹红Ⅰ～Ⅳ的现场快速定性检测提供技术支撑。