结核病患者淋巴细胞程序性细胞死亡受体-1表达变化的研究进展

裴红运,文 洁,山凤莲

(1.济宁医学院 临床医学院,山东 济宁 272000;2.济宁医学院附属医院 呼吸与危重症医学科,山东 济宁 272000)

结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一种慢性感染性疾病,也是世界范围内引起死亡的主要疾病之一,在过去200年里,总共约有10亿人死于TB[1]。而且MTB对环境抵抗力强,易产生耐药性,在人类宿主中存活有高度适应性[2],为人类健康事业发展带来巨大挑战。

淋巴细胞在机体免疫应答中发挥重要作用,已有相关研究通过分析淋巴细胞各亚群的数量和功能来评估TB患者的免疫状况及免疫平衡。米洁等[3]报道大部分TB患者淋巴细胞亚群中CD4+T细胞与健康对照组有显著性差异,这或为导致TB患者免疫功能低下和免疫紊乱的原因之一。程序性细胞死亡受体-1(programmed cell death protein-1,PD-1)是一种免疫检查点分子,主要表达在活化的CD4+T、CD8+T细胞上,与其配体细胞程序性死亡-配体(Programmed cell death ligand ,PD-L)1或PD-L2结合后在免疫应答中主要发挥负性调控作用[4]。目前相关研究表明,MTB抗原可以显著激活PD-1/PD-L1途径,以驱动淋巴细胞的免疫反应,从而对机体的免疫耐受起调节作用。本文就近年来国内外PD-1在TB患者淋巴细胞上表达的变化及PD-1对MTB感染的影响的研究进展进行综述,以期对TB有进一步的认识。

1 PD-1在T淋巴细胞上的研究

人体对MTB感染的免疫反应主要包括细胞介导的免疫反应和迟发性过敏,二者均由T淋巴细胞介导[5]。PD-1与PD-L1/L2通过受体分子胞浆尾部的免疫受体酪氨酸抑制基序激发抑制信号,从而引起T细胞的生长代谢以及功能特性改变,最终导致免疫抑制[6]。

1.1PD-1在MTB感染患者T细胞上的表达 目前的研究多认为PD-1在TB患者T淋巴细胞上高表达,有研究表明相比于潜伏性结核感染患者及健康个体,PD-1在TB患者尤其是活动性结核感染(Active-tuberculosis,ATB)患者外周血中CD4+T、CD8+T淋巴细胞上显著高表达[7-8],其中Day等[8]发现MTB特异性CD4+T细胞上PD-1的表达高于CD8+T细胞。此外,为了研究是否只有人类感染MTB后PD-1在T淋巴细胞有差异,也有团队通过应用MTB抗原等建立了一个T细胞功能障碍的小鼠模型,并根据不同方案不同抗原进行实验,他们最终得出的实验结果为持续抗原刺激组CD4+T、CD8+T细胞表面PD-1的表达显著高于抗原瞬时组和初治组,且CD4+T细胞上PD-1表达增加的比例较CD8+T细胞明显,这也从不同物种层面上为上述PD-1在TB患者T淋巴细胞的表达研究做了补充[9]。

T淋巴细胞有调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)CD4+CD25+Foxp3+、应答性T细胞(responder T cell,Tresp)CD4+CD25-和效应性T细胞(effector T cell,Teff)CD4+CD25+Foxp3-等不同的T细胞亚群(Foxp3+是Tregs的特异转录因子,可调节Treg的功能,被认为是Treg的标志分子),因此PD-1在不同T细胞亚群上的表达也引起人们的兴趣。如Shen等[10]对ATB患者CD4+T细胞亚群进行相关研究,通过他们的研究结果可知在ATB患者中PD-1在这3个T细胞亚群上的表达水平均明显高于正常人,并且在有效的抗结核治疗后Tresp和Teff细胞亚群上PD-1的表达水平较治疗前显著降低,这也更充分的证明PD-1在MTB感染患者T淋巴细胞上高表达。

然而,最近的一项研究发现ATB患者外周血中CD4+CD25+CD127LOW/Treg上PD-1和PD-L1水平均低于正常人,而Treg细胞在TB患者外周血中的比例高于健康对照组[11](CD127分子是新发现的Treg特异性标记分子,比Foxp3更容易检测,且CD127低表达与Foxp3表达高度相关[12]。因此,CD4+CD25+CD127Low/Treg能更好地表征Treg群体在免疫抑制和调节适应性免疫应答中起关键作用[13])。我们得知Treg是一种在免疫反应中发挥负面调节作用的T细胞,可抑制功能性CD4+/CD8+T细胞的活化和增殖,而PD-1和PD-L1可共同传递抑制信号抑制抗结核免疫反应,PD-1/PD-L1的表达下调降低了Treg的激活阈值,从而会促进ATB患者外周血中CD4+CD25+CD127Low/Tregs的增殖[14]。PD-1在Treg上表达结果的不同表明PD-1在Treg细胞发育和功能维持中具有特殊作用,PD-1/PD-L1途径负调控Treg增殖和功能。此外,Treg细胞在MTB感染中可能也发挥多重作用,并不单纯的抑制免疫。因此我们推测当受到MTB刺激后,Treg上PD-1/PD-L1负共刺激因子表达下调,促进其增殖并对功能性T细胞产生抑制,为防止免疫过度,PD-1上调抑制Treg继续扩增。另一方面,PD-1在Treg上表达不同可能由于其与MTB特异性T细胞、非MTB特异性T细胞分布有关。此外,不同的Treg细胞亚群上的PD-1表达可能也不同。总之,PD-1在Treg上的确切表达还仍需进一步研究。

1.2PD-1在TB不同来源标本中T细胞上的表达 上述研究团队检测的淋巴细胞标本基本都是取自实验对象的外周血,而MTB感染还可能会导致胸腔积液、结核性胸膜炎等情况。因此,对于其他标本来源的淋巴细胞上PD-1的表达也需要进一步探索。在TB患者肺部感染中,支气管肺泡灌洗液也是常用的研究样本,可与外周血进行比较从而更动态全面的评估研究结果,Day等[8]发现针对同一结核潜伏感染患者支气管肺泡灌洗液样本中CD4+T和CD8+T细胞上PD-1的表达显著高于外周血样本。除此之外,PD-1在结核性胸膜炎患者胸腔积液单核细胞中CD4+T和CD8+T细胞上的表达高于其外周血单核细胞,也高于健康对照组的外周血单核细胞[15-16]。这些结果可能是因为人类感染MTB期间PD-1在感染部位高度表达引起。

2 阻断PD-1对TB患者T淋巴细胞的影响

目前的研究发现PD-1在慢性感染、各种恶性肿瘤中起限制病原体及肿瘤特异性T细胞的功能[17-18],并且通过阻断PD-1受体或其配体可以增强抗肿瘤细胞毒性T细胞的数量和功能,进而控制肿瘤的进一步恶化,目前已有多种PD-1靶向药物被批准用于治疗各种恶性肿瘤。对于TB等感染性疾病来说,通过阻断PD-1/PD-L1途径来增强T细胞功能或许也是一种重要的治疗方法。

2.1阻断PD-1可恢复T细胞的免疫功能 目前多数研究认为MTB特异性CD4+T、CD8+T细胞产生的干扰素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(Tumour Necrosis Factor alpha,TNF-α)是控制MTB感染的基础,阻断PD-1受体可提高IFN-γ+T细胞的比例且显著提高了ATB患者MTB特异性CD4+T和CD8+T细胞分泌IFN-γ,这也证明PD-1受体对T细胞的效应功能起负调节作用[16]。此外,阻断PD-1受体不仅能增加单个细胞因子的产生,还增加多功能T细胞双重细胞因子产生(如IFN-γ+TNF-α、IL-2+IFN-γ+等)的频率[19],这可能与MTB感染的恢复密切相关。在不同物种之间,阻断PD-1后影响的T淋巴细胞及其功能并不完全相同。在恒河猴模型中,阻断PD-1受体并没有增加MTB特异性CD4+T细胞而是增加了CD8+T细胞的数量或功能[20]。而在人类TB中阻断PD-1/PD-L1途径则可以部分恢复MTB特异性CD4+T细胞的功能(包括分泌白细胞介素-2、TNF-α、IFN-γ和其体外细胞增殖),也可显著促进CD4+T细胞的增殖[21]。这其中具体的原因我们尚不得知,需要进一步研究。

此外,机体识别MTB感染细胞后免疫细胞会分泌IFN-γ,导致巨噬细胞激活,从而增加巨噬细胞对CD8+T细胞介导的细胞毒敏感性。而CD8+T细胞不仅能产生IFN-γ,还能杀死感染的巨噬细胞,即阻断PD-1受体可以增强CD8+T细胞的细胞毒活性进而导致巨噬细胞的死亡易感性增加。正如Shen等[7]研究中描述的阻断PD-1受体后,巨噬细胞的吞噬功能和细胞内杀伤活性明显增强。其他相关研究报道也得出体外阻断PD-1受体可增加CD4+T细胞炎性细胞因子的产生,并诱导CD8+T细胞的细胞毒作用[8,15]。

2.2阻断PD-1可对MTB感染产生负面作用 虽然阻断PD-1/PD-L1途径可以导致产生IFN-γ及TNF-α的细胞增加和CD8+T细胞脱颗粒并激活巨噬细胞从而发挥免疫保护作用,然而阻断PD-1受体对于MTB感染可能也会导致相反的作用。Kauffman等[20]在MTB感染的恒河猴模型上阻断PD-1受体后发现炎症较前进展,并且肺肉芽肿中细菌负荷增加。在小鼠模型中PD-1基因敲除的小鼠有更高的炎症水平及细菌负荷[22],它们的MTB抗原特异性T细胞增殖较野生型小鼠显著降低,对TB的易感性增加[23]。这些动物模型中的研究结果可能与T淋巴细胞产生的IFN-γ、TNF-α和Treg细胞有关。然而,在PD-1敲除小鼠模型中,PD-1的缺乏并不会导致所有的分枝杆菌感染加剧,比如有报道显示卡介苗在PD-1敲除小鼠中更容易被清除[24]。此外,除了上述在动物模型中的研究,在接受PD-1/PD-L1阻断治疗的癌症患者中,也经常有TB重新激活的报道[25]。以上这些提示PD-1途径在MTB感染中具有多方面作用,还需要我们更加深入的探索。

3 PD-1在B淋巴细胞上的表达

B淋巴细胞能在抗原刺激下分化为浆细胞,浆细胞合成和分泌抗体从而主要参与机体的体液免疫。过去的研究中主要认为宿主对胞内病原体的防御是由细胞免疫介导的,而对胞外病原体的反应是由B细胞产生的抗体介导[26-27]。然而,近年的研究表明B细胞除产生抗体外,还是活性抗原提呈细胞,并可以通过影响其他免疫细胞的功能来促进宿主对病原体的防御[28]。

大部分研究揭示了PD-1及其配体在TB患者T细胞、B细胞和单核细胞表面的表达均明显上调[10,16,21],并且Singh等[29]发现肺结核患者B细胞上PD-1及其配体的表达低于CD14+单核细胞。胥萍[30]研究得出肺结核患者外周血单核细胞及B细胞表面PD-L1的表达显著高于健康对照组,并且认为PD-L1在B淋巴细胞上高表达能增加与T细胞表面PD-1受体的相互作用,共同调节负性免疫信号,进一步抑制T细胞的免疫功能。目前关于PD-1信号通路在TB中单独B淋巴细胞上的研究仍较少,且对于其具体作用机制等还不明确,尚需进一步深入研究。

4 PD-1在自然杀伤细胞上的表达

自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)是一类无需预先致敏就能对肿瘤及感染细胞起到非特异性杀伤作用的淋巴细胞,且其活性通过激活受体和抑制受体之间的平衡调节。基于CD56受体的差异表达,NK细胞主要有两种细胞亚群,其中CD56dim NK细胞占大多数,主要介导先天免疫调节和抗体依赖性靶细胞裂解,而CD56bright NK细胞在产生细胞因子方面更有效[31]。在T细胞活化等适应性免疫之前,病原体识别受体识别先天性免疫是抵御病原体的主要防御手段[32],而NK细胞可以联系先天性免疫和适应性免疫介导的反应、诱导细胞毒性和细胞因子信号传导等。此外,NK细胞还通过释放穿孔素和颗粒溶素等细胞毒分子、间接传递适应性免疫信号等多种机制帮助宿主抵抗病原体感染[33]。

目前TB患者NK细胞上PD-1的表达研究仍较少,具体机制尚不明确。Hassan等[34]发现PD-1并不抑制NK细胞的杀伤活性,而是通过调节细胞因子、介导其效应功能等机制调节免疫系统。Alvarez等[35]研究发现MTB感染患者NK细胞上PD-1的表达显著高于健康人,并且胸腔积液中NK细胞的PD-1/PD-L1水平明显高于外周血,即在活动性病变部位表达水平较高。此外,细胞因子如Th2、Th17会降低胸水NK细胞的PD-1水平,而IFN-γ则增加PD-1的表达。总的来说,MTB刺激会上调NK细胞上的PD-1水平,通过一系列反应最终抑制NK细胞抵御病原体的效应功能;而阻断PD-1受体会增加NK细胞的数量,以调节宿主的免疫应答。

5 小结

通过之前的研究发现,在TB等慢性感染病中,长时间的抗原暴露可能会诱导T细胞的终末分化趋向功能性“衰竭”,从而抑制宿主的免疫功能,而阻断免疫检查点抑制受体则可以恢复宿主免疫调节。近年来研究比较多的免疫检查点有PD-1、淋巴细胞激活基因-3、T细胞免疫球蛋白-3、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4,皆为抑制性受体,能发挥介导调控免疫作用。其中关于PD-1途径在TB中的作用研究逐年增多,但PD-1在TB淋巴细胞上具体的表达及作用机制仍需进一步深入研究,尤其是B细胞、NK细胞。此外,PD-1/PD-L1还表达于巨噬细胞、抗原提呈细胞、树突细胞等其他免疫细胞中,因此PD-1/PD-L1在这些细胞的表达及作用或许也是一个新的研究方向。通过研究PD-1在TB淋巴细胞上的表达及意义,可以为抗结核治疗提供新的思路,进而对TB产生更深入的认识,有助于促进人类卫生健康事业发展。