基于TGF-β1/Smad2/3信号通路研究莲心碱对高血压小鼠肾间质纤维化的保护作用

王美玲，陈达鑫，2，3，贾沛芝，赵春雨，许瑶瑶，姚 琳，林 珊，2，3*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；3.福建省中西医结合防治重大心血管慢病协同创新中心，福建 福州 350122）

高血压病是一种常见的心脑血管疾病，而肾脏损害是高血压重要的靶器官损害之一，高血压已成为导致终末期肾病的第二大病因［1］。肾脏纤维化既是高血压肾病的最终标志，又是慢性肾脏病进展为终末期肾脏病的最终病理归途［2-4］，其发生、发展与肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）系统激活引起的血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）异常表达密切有关［5-6］。转化生长因子-β1（transform growth factor-β1，TGF-β1）是AngⅡ的重要下游因子［7］，Ang Ⅱ浓度的异常升高可刺激肾脏成纤维细胞合成和分泌TGF-β1［8］，后者可通过激活Smad 依赖途径协同调控靶基因转录及蛋白表达，诱导肾纤维化过程［9］。

莲子心是睡莲科睡莲属植物莲Nelumbo nuciferaGaertn.成熟种子中间绿色去除子叶的胚［10］，性寒味苦，具有清心安神、交通心肾、涩精止血的作用。莲子心主要活性成分包括生物碱类和黄酮类等成分［11-12］，莲心碱是莲子心的重要活性成分之一，具有降血压、抗心律失常、抗脂质氧等作用［13］。目前莲心碱降低血压和改善肾脏纤维化的机制研究尚不明确，因此本课题组基于TGF-β1/Smad2/3 信号通路探讨莲心碱对高血压小鼠肾纤维化的作用机制，进一步研究莲心碱治疗高血压减轻靶器官损害的作用机制，为莲心碱的临床应用提供科学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 6周龄健康C57BL/6雄性小鼠18只，体质量25～30 g，购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005，置于福建中医药大学动物实验中心饲养。饲养环境温度20.8～24.3 ℃，每日温差＜4 ℃；相对湿度47.2%～67.2%，换气15 次/h；12 h 光/暗交替；喂养正常饲料，自由饮水和饮食，每2～3 d 更换垫料。

1.2 实验药物 莲心碱（C37H42N2O6，北京索莱宝科技有限公司，批号：SL8100），溶于生理盐水，现配现用。

1.3 实验试剂 天狼星红染色液、苏木素染色液、Alzet 植入式胶囊渗透压泵均购自北京索莱宝科技有限公司（货号：G1472、G1080、alzet-2004）；TGFβ1、Smad2/3 均 购 自 美 国Abbkine 公 司（货 号：ABP52598、ABP0158）；p-Smad2/3（美国CST公司，货号：8828S）；可溶性胶原蛋白（Collagen）Ⅰ、CollagenⅢ和二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司（货号：66761-1-lg、22734-1-AP、SA00001-2）；Ang Ⅱ（英国Abcam 公司，货号：ab120183）。

1.4 实验仪器 无创鼠尾血压仪（美国Kent Scientific 公司）；病理切片机（德国Leika 公司）；石蜡包埋机、生物组织自动脱水机均购自湖北孝感亚光医用电子技术有限公司；垂直电泳槽、Chemi Doc XRS＋化学发光成像系统（美国Bio-Rad 公司）；DM2700P偏振光显微镜（德国Leica 公司）。

2 实验方法

2.1 分组和造模 18 只C57BL/6 雄性小鼠随机分成对照组、模型组和莲心碱组各6 只。对照组小鼠背部皮下植入含生理盐水的渗透微型泵，模型组和莲心碱组小鼠背部皮下植入含同等体积Ang Ⅱ溶液的渗透微型泵，并以500 ng/（kg·min）持续释放28 d。该造模方式为国际公认的高血压研究模型，埋泵后出现收缩压（systolic blood pressure，SBP）＞120 mm Hg，提示建模成功。

2.2 干预 于造模后第2 天开始给药，莲心碱组按5 mg/（kg·d）腹腔注射150 μL 莲心碱溶液，对照组、模型组腹腔注射等体积生理盐水，均连续干预4周。

2.3 血压测量 分别在造模前1 天和造模后第0、7、14、21、28 天检测小鼠的尾动脉SBP、舒张压（diastolic blood pressure，DBP）和平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）。将小鼠装入小鼠固定器中，在距小鼠尾部约0.5 cm 的位置套上闭塞套，然后套入容积压力传感器，让小鼠在黑暗环境下平息10 min后，开始进行血压测量。每只小鼠至少测量20个循环，记录小鼠的SBP、DBP 和MAP。

2.4 取材 末次给药后，麻醉小鼠，打开腹腔，去除小鼠肾脏表面脂肪组织和被膜，快速剥离两侧肾脏组织。将小鼠的两侧肾脏置于标尺表方格中，于相同高度对3 组肾脏进行观察拍照，对比3 组肾脏大小。将肾脏组织自肾门处作冠状切面对半剖开，取左侧肾脏组织的1/2 置于4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、石蜡包埋。

2.5 天狼星红染色法观察肾脏胶原纤维沉积情况 肾组织经固定、包埋、切片以及脱蜡，滴加天狼星红染色液后置于湿盒室温孵育1 h。将肾组织玻片放入苏木素溶液中浸泡1 min 后，置于PBS 溶液中洗净，晾干，滴加中性树胶封片，置于室温晾干。使用偏振光显微镜进行观察并采集图像，观察肾脏组织内胶原纤维分布。

2.6 Western blot 检测肾组织相关蛋白表达 提取肾脏组织蛋白，充分裂解后取上清，BCA 法检测蛋白浓度。提取的蛋白经变性、电泳、转膜、封闭后，置 于TGF-β1（1∶1 000）、Smad2/3（1∶1 000）、p-Smad2/3（1∶1 000）、Collagen Ⅰ（1∶1 000）、CollagenⅢ（1∶1 000）一抗中4 ℃孵育过夜。TBST 清洗后置于二抗（1∶10 000）中室温摇床孵育1 h。滴加显影液曝光，运用ImageJ 软件对目的条带的灰度值进行相对表达量分析。

2.7 统计学方法 采用SPSS 23.0 软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，组内不同时间点比较采用重复测量方差分析；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 3 组造模后血压指标比较 与对照组比较，模型组造模第7、14、21、28 天SBP、DBP 及MAP 均明显提高（P＜0.05）；与模型组比较，莲心碱组造模第14、21、28天SBP、DBP及MAP均明显降低（P＜0.05）。见图1。

图1 3 组造模后血压指标比较

3.2 3 组肾脏重量比较 与对照组比较，模型组肾脏重量明显提高（P＜0.05）；与模型组比较，莲心碱组肾脏重量明显降低（P＜0.05）。见图2、图3。

图2 3 组肾脏形态图

图3 3 组肾脏重量比较

3.3 3组肾脏组织胶原纤维沉积情况比较 对照组肾间质中未见明显胶原纤维沉积；模型组肾间质可见大面积呈红色或黄色的Ⅰ型胶原纤维，并伴有部分绿色Ⅲ型胶原纤维；莲心碱组肾间质纤维化程度较模型组明显下降。见图4。

3.4 3 组肾脏组织相关蛋白表达量比较 与对照组比较，模型组小鼠肾脏组织Collagen Ⅰ、CollagenⅢ、TGF-β1 蛋白表达量及p-Smad2/3 和Smad2/3比值均明显提高（P均＜0.05）；与模型组比较，莲心碱组肾脏组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1蛋白表达量及p-Smad2/3 和Smad2/3 比值均明显降低（P均＜0.05）。见表1、图5。

表1 3 组肾脏组织相关蛋白表达量比较（±s）

表1 3 组肾脏组织相关蛋白表达量比较（±s）

注：与对照组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

Collagen Ⅲ0.95±0.15 1.39±0.051）1.12±0.092）组别对照组模型组莲心碱组n3 3 3 TGF-β1 0.99±0.03 1.32±0.121）1.10±0.072）p-Smad2/3和Smad2/3比值0.54±0.06 1.16±0.021）0.75±0.242）Collagen Ⅰ1.27±0.01 1.94±0.151）1.37±0.022）

图5 3 组肾脏组织相关蛋白条带图

4 讨 论

肾脏作为调节血压的重要器官，同时也是高血压所致损害的靶器官。高血压病不仅会累及肾小球，持续性的高血压还会损伤肾小管细胞，导致肾小管间质纤维化［14］。TGF-β1/Smads 信号通路在肾纤维化中起着至关重要的作用，是肾纤维化最主要和最经典的信号通路之一［15］。当血压持续升高时，Ang Ⅱ释放增多，可直接调控TGF-β1 基因转录，也可以通过其他通路间接引起TGF-β1 转录、释放增多［16］。TGF-β1 是促进肾纤维化的重要细胞因子之一［17］，其通过Smad 蛋白家族的磷酸化和激活下游相关基因如Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ来诱导肾成纤维细胞分化［18］。因此，抑制TGF-β1 及其下游基因的活性可能会减少肾成纤维细胞的形成和过度聚集，从而有效缓解肾损伤中的纤维化病变［19］。

近年研究发现，莲心碱用于治疗高血压，具有明显的抗炎、抗氧化作用，并能有效减轻肾脏损伤［20-23］。研究结果显示，与对照组比较，模型组小鼠收缩压、舒张压及平均动脉压等血压指标均明显提高，小鼠重量明显升高，肾脏组织经天狼星红染色后可见胶原纤维沉积，肾脏组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1蛋白表达量及p-Smad2/3和Smad2/3比值均明显提高。经莲心碱干预后小鼠血压指标明显降低，肾脏重量明显下降，肾脏组织胶原纤维沉积明显下降，肾脏组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1 蛋白表达量及p-Smad2/3 和Smad2/3 比值均明显降低。可见，高血压能够引起肾脏组织肾脏肿大及肾间质纤维化，而莲心碱能够有效改善肾脏损伤，减少肾组织胶原沉积，且与TGF-β1/Smad2/3信号通路密切相关。

综上，莲心碱可有效抑制高血压所致的肾脏肿大及肾组织胶原纤维沉积，其改善肾损伤的作用机制可能与TGF-β1/Smad2/3 信号通路发挥作用有关。