清宣醒鼻法对儿童变应性鼻炎转录组学的影响

艾 斯，余岩雁，江宝春，郑 健

（福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004）

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是儿童最常见的慢性呼吸道疾病之一，也是具有挑战性的难治性疾病，其发病率居高不下［1］。AR 治疗的关键在于避免接触过敏原及药物治疗（包括糖皮质激素、抗组胺药、白三烯受体拮抗剂、肥大细胞膜稳定剂、减充血剂、抗胆碱药等），但临床疗效尚不理想，并发症较多，因此研究安全、高效的AR 治疗药物具有重要意义。AR 属中医学“鼻鼽”范畴，急性发作期以肺经伏热为病机关键，因此，本课题组提出清宣醒鼻法是发作期的核心治法［2］，醒鼻宣窍汤内服配合醒鼻凝胶滴鼻剂滴鼻是清宣醒鼻法的具体体现。转录组测序（RNA sequencing，RNA-seq）是用高通量基因测序技术测定特定标本的几乎全部转录本序列，可从基因水平对AR 的发病机制进行更精确的探究，对AR治疗关键靶点的挖掘具有重要意义［3］。本课题研究利用RNA-seq 技术探讨AR 患儿转录调控的基因表达特征，进一步明确清宣醒鼻法治疗AR 的药物作用靶点，为清宣醒鼻法治疗AR 的临床应用提供理论依据，丰富中医药治疗AR 的理论基础。

1 临床资料

1.1 病例选择标准

1.1.1 西医诊断标准 AR 诊断标准参照《变应性鼻炎诊断和治疗指南（2015 年，天津）》［1］。① 症状：打喷嚏、清水样涕、鼻痒和鼻塞等症状出现2 个或以上，每天症状持续或累计在1 h 以上，可伴有眼痒、流泪和眼红等眼部症状；② 体征：常见鼻黏膜苍白、水肿，鼻腔水样分泌物；③ 变应原检测：至少1 种变应原皮肤点刺试验和/或血清特异性IgE阳性。

1.1.2 中医辨证要点 参照《中医儿科临床诊疗指南·小儿鼻鼽》［4］中肺经伏热证辨证要点。

1.1.3 纳入标准 ① 符合诊断及辨证标准；② 年龄3～14 岁；③ 处于AR 急性发作期；④ 患者及家属同意参与本研究，并签署知情同意书。

1.1.4 排除标准 ① 合并有其他变态反应性疾病，需要长期坚持服药而不能停药者；② 已接受其他相关疾病的治疗，可能影响本研究效应指标观测者；③ 合并有支气管哮喘急性发作、呼吸道感染、慢性鼻-鼻窦炎、上气道咳嗽综合征、分泌性中耳炎、鼻息肉、鼻部肿瘤等疾病者；④ 合并有心、脑血管、肝、肾和造血系统等严重危及生命的原发性疾病以及精神病患儿；⑤ 依从性差，不配合诊疗及随访者。

1.2 一般资料 选取2020 年7 月—2021 年7 月于福建中医药大学附属人民医院门诊就诊的肺经伏热型AR患儿20例，其中男11例，女9例；年龄（8.12±1.33）岁。本试验经福建中医药大学附属人民医院医学伦理委员会审批通过（2019-037-01）。

2 方 法

2.1 治疗方法 内服醒鼻宣窍汤，药物组成：蜜麻黄6 g，苦杏仁6 g，蒲公英15 g，辛夷9 g，白芷9 g，防风6 g，蝉蜕6 g，徐长卿9 g，苍耳子9 g，川芎6 g，丝瓜络10 g，甘草3 g。6 岁以上儿童采用此剂量，6 岁以下儿童中药剂量酌情减少。药物加减：风热甚者可加金银花、连翘；伴有咽痒者可加射干；喉核肿大者加玄参、皂角刺。中药饮片由福建中医药大学附属人民医院负责统一采购及质量监控，水煎服，每日1 剂，分次温服。外用醒鼻凝胶滴鼻剂（福建中医药大学附属人民医院院内制剂，闽药制字Z20110006），每次每鼻孔1 滴滴鼻，早晚各1 次，连续治疗4 周。

2.2 观察指标

2.2.1 安全性指标 AR 患儿分别于治疗前后检测血常规、尿常规、肝功能、肾功能、电解质。

2.2.2 症状评分 参照《变应性鼻炎诊断和治疗指南（2015 年，天津）》［1］症状评分标准，分别于治疗前和治疗后1、2、3、4 周评估症状改善程度。主要评价指标包括喷嚏、流涕、鼻痒、鼻塞、眼痒和异物感、眼红和流泪等，患儿症状严重度按0～3 分进行评价，0 分为无症状；1 分为轻度症状（症状轻微，易于忍受）；2 分为中度症状（症状明显，令人厌烦，但可以忍受）；3 分为重度症状（症状不能忍受，影响日常生活和/或睡眠）。

2.2.3 RNA-seq 和数据处理 ① RNA 抽提：治疗前后采集血液2 mL，利用淋巴细胞分离液分离PBMC，Trizol 裂解液提取总RNA；② RNA 质检：每个样本取1 μL RNA 测量浓度，取300 ng 1%琼脂糖进行电泳检测，进行质检；③ RNA 文库构建：RNA样品与探针杂交，分别进行RNA 片段化反应、第1链和第2 链cDNA 合成反应、接头连接反应、PCR 反应、文库扩增反应、Qubit 定量，2%琼脂糖电泳文库质检；④ 数据处理：采用Illumina Hiseq 测序平台进行高通量测序，利用Skewer 软件和FastQC 软件对预处理数据进行质量控制分析和统计。

2.2.4 qPCR 定量分析 上述样本通过GO 功能、KEGG Pathway 及疾病关联分析，在AR 患儿中发现了具有显著差异的基因群和信号通路，为了进一步验证RNA-seq 准确性，课题组从核心差异表达基因中筛选出与炎症和过敏反应相关的基因，进一步扩大样本进行qPCR 定量验证丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B（Akt1）、B 淋巴细胞瘤-2 样蛋白1（BCL2L1）、白细胞分化抗原36（CD36）、E1A 结合蛋白P300（EP300）、组蛋白脱乙酰基酶11（HDAC11）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、髓细胞增生蛋白（MYC）、人蛋白酶体α 亚基3 型（PSMA3）、非ATP 酶蛋白酶体26S 亚基6（PSMD6）、核受体共激活因子NCOA62抗体（SNW1 又名NCOA62 抗体）、转录辅抑制子4（TLE4）、Toll 样受体1（TLR1）等基因，证实其差异性。于治疗前后分别采集AR 患儿血液2 mL，分别进行总RNA 抽提、逆转录、荧光定量PCR 扩增（包括引物设计和PCR 反应）。序列参照Gene Bank 数据库中各目的基因的序列，NCBI Primer-blast 设计引物，苏州金唯智生物科技发展有限公司合成并提供引物，引物序列见表1。

2.3 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计学软件对数据进行分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，组内治疗前后比较采用配对样本t检验，组内不同时间点比较采用重复测量方差分析。

3 结 果

3.1 AR 患儿治疗前后症状评分比较 AR 患儿治疗后1、2、3、4 周与治疗前比较，喷嚏、流涕、鼻痒、鼻塞、眼痒和异物感、眼红和流泪等症状评分出现明显下降（P＜0.01），尤其在治疗后4 周以上症状得到非常显著的改善。见表2。

表2 AR 患儿治疗前后症状积分比较（n=20，±s） 分

表2 AR 患儿治疗前后症状积分比较（n=20，±s） 分

注：与治疗前比较，1） P＜0.01。

治疗后4周0.45±0.501）0.85±0.361）0.25±0.431）0.37±0.481）0.15±0.361）0.00±0.001）2.00±0.841）症状指标喷嚏流涕鼻痒鼻塞眼痒和异物感眼红和流泪总分治疗前2.55±0.50 2.95±0.38 2.10±0.62 2.40±0.58 1.95±0.80 0.85±0.48 14.10±2.00治疗后1周1.85±0.481）2.20±0.511）1.45±0.591）1.60±0.581）1.25±0.771）0.40±0.491）9.60±2.761）治疗后2周1.10±0.301）1.35±0.481）0.70±0.641）1.05±0.501）0.60±0.581）0.15±0.361）5.35±1.931）治疗后3周0.80±0.401）1.00±0.451）0.40±0.491）0.70±0.711）0.15±0.481）0.00±0.001）3.10±1.261）

3.2 RNA-seq

3.2.1 整体基因表达水平比较分析 AR 患儿mRNA 和lncRNA 表达量丰度Boxplot 图，一般来说FPKM≥0.1 表示转录本有表达，结果显示AR 患儿转录组表达量FPKM 值均＞5，且各样本表达量趋于一致。见图1。

图1 AR 患儿mRNA 和lncRNA 表达量丰度Boxplot 图

3.2.2 差异表达基因筛选 AR 患儿中筛选出较多有差异的mRNA、lncRNA、cirRNA，根据|log2FC|≥1和P＜0.05 这2 个条件需同时满足的前提下，筛选AR 患儿治疗前后的差异转录本。共筛选出3 776个差异mRNA，火山图中的紫色点和散点图中的绿色点提示治疗后较治疗前下调基因点共有1 858个，火山图中的蓝色点和散点图中的红色点提示治疗后较治疗前上调基因点共有1 918 个。见图2。

图2 AR 患儿治疗前后mRNA 火山图和散点图

共筛选出541 个差异lncRNA，火山图中的紫色点和散点图中的绿色点提示治疗后较治疗前下调基因点共有297 个，火山图中的蓝色点和散点图中的红色点提示治疗后较治疗前上调基因点共有244 个。见图3。

图3 AR 患儿治疗前后lncRNA 火山图和散点图

共筛选出683 个差异cirRNA，火山图中的紫色点和散点图中的绿色点提示治疗后较治疗前下调基因点共有346 个，火山图中的蓝色点和散点图中的红色点提示治疗后较治疗前上调基因点共有337 个。见图4。

图4 AR 患儿治疗前后cirRNA 火山图和散点图

3.2.3 目的基因集GO 功能分析 显著富集GO 柱状图，针对目的基因集，采用TopGO 软件进行GO 功能分析，对全基因和目的基因集进行功能注释和归类。见图5。

图5 显著富集GO 柱状图

3.2.4 目的基因集显著富集KEGG pathway 分析针对显著富集mRNA、lncRNA、cirRNA 基因进行KEGG 数据库中Pathway 的功能注释和归类，以下为显著富集的KEGG pathway 柱状图。横坐标代表显著富集的KEGG pathway 名称，纵坐标代表-log10（P值）。红色柱表示显著的Pathway 通路（P≤0.05），纵坐标越显著表示该Pathway 越富集显著。见图6～图8。

图6 显著富集mRNA KEGG pathway 柱状图

图7 显著富集lncRNA KEGG pathway 柱状图

图8 显著富集cirRNA KEGG pathway 柱状图

3.2.5 差异基因表达谱 AR 患儿治疗后Akt1、BCL2L1、CD36、EP300、PSMA3、PSMD6、SNW1、TLE4等基因表达水平较治疗前明显下降（P＜0.05），HDAC11、MAPK1、MYC、TLR1 等基因表达水平较治疗前明显升高（P＜0.05）。见图9～图10。

图9 治疗 前后AR 患儿Akt1、BCL2L1、CD36、EP300、PSMA3、PSMD6、SNW1 及TLE4 mRNA 表达水平比较

图10 治疗前后AR 患儿HDAC11、MAPK1、MYC及TLR1 mRNA 表达水平比较

3.3 安全性分析 AR 患儿治疗前后血常规、尿常规、肝功能、肾功能、电解质等指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

4 讨 论

AR属于中医学“鼻鼽”范畴，又名“鼽喷”“鼽嚏”“鼽水”等，关于该病的记载最早见于西周《礼记》。AR 患儿素体正气不足，易为外邪所侵，风为百病之长，亦为阳邪，易袭阳位，风邪上犯，肺首当其冲。风性走窜，疏散不利，久病循经入里，内伏手太阴肺经而为伏风，外风引动伏风则发鼻鼽。鼻为肺之门户，故风邪侵袭则出现鼻塞、鼻痒、喷嚏、流涕等症状，风邪留恋，故而时作时止，反复不愈，急性发作期可兼夹热邪。因此，肺经伏热是AR 急性发作期的关键病机，采用清宣醒鼻法治疗AR 获得显著疗效。

醒鼻宣窍汤来源于福建省名中医郑健教授的临床经验方，方中蜜麻黄宣发肺气以承上，苦杏仁肃降肺气以启下，二者共为君药，宣肃肺气而通利鼻窍；蒲公英清热解毒；辛夷发散风寒，通鼻窍；白芷祛风、燥湿、消肿；防风祛风解表；蝉蜕祛风止痒；徐长卿祛风通络、止痒消肿；苍耳子祛风通窍；川芎辛温香窜，走而不守，引药达病所；丝瓜络行气通络、通利鼻窍；甘草调和诸药。全方共奏疏风、醒鼻、宣窍之功，临证每获良效。中药醒鼻方是福建中医药大学附属人民医院名老中医黄守林主任根据多年的临床经验拟定的鼻腔局部专用经验方，郑健教授团队已将其改良为醒鼻凝胶滴鼻剂，纵观全方，辛开苦降、寒温并用，具有疏风止痒、醒鼻开窍之功效［5］。本研究采用内服醒鼻宣窍汤联合外用醒鼻凝胶滴鼻剂治疗AR 患儿，获得显著疗效，可明显改善AR患儿鼻塞、鼻痒、喷嚏、流涕等症状，鼻炎症状积分明显下降（P＜0.01）。

RNA-seq 是对特定标本的mRNA 进行研究，是一种无偏移的探究转录组基因功能和结构、识别分子通路的方法，对疾病发病机制和药物治疗关键靶点的探究具有重要意义。本研究采用RNA-seq 技术筛查AR 患儿特异性的差异基因表达，共筛选出3 776 个差异mRNA，治疗后与治疗前相比，上调基因1 918 个，下调基因1 858 个；筛选出541 个差异lncRNA，治疗后与治疗前相比，上调基因244 个，下调基因297 个；筛选出683 个差异cirRNA，治疗后与治疗前相比，上调基因337 个，下调基因346 个。通过GO 功能、KEGG Pathway 及疾病关联分析，在以上筛选出的差异显著基因群中，进一步筛选出与炎症和变态反应相关的基因，为了进一步验证RNA-seq 准确性，课题组扩大样本进行qPCR 定量验证，最终确定参与AR 慢性炎症反应的基因：

Akt1、BCL2L1、CD36、EP300、HDAC11、MAPK1、MYC、PSMA3、PSMD6、SNW1、TLE4、TLR1 等。其中治疗后Akt1、BCL2L1、CD36、EP300、PSMA3、PSMD6、SNW1、TLE4 等基因表达水平较治疗前明显下降（P＜0.05），HDAC11、MAPK1、MYC、TLR1 等基因表达水平较治疗前明显升高（P＜0.05），提示以上基因可能参与AR 的慢性炎症反应，并且可能成为清宣醒鼻法治疗AR 患儿的药物作用关键靶点。