紫白膏对大鼠肛周创面愈合及TGF-β1、Smad3表达的影响

王 菁，汪昭楚，李 阳，黄 娟，石 荣

（福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004）

中国有50%～51%的人群罹患不同程度的肛肠疾病，其中以痔疮患病率最高，达49.14%［1-2］，给社会带来巨大的医疗负担。手术是临床治疗重度痔疮、肛瘘、肛周脓肿等肛肠疾病的主要方法。术后可引起肛周组织不同程度的刺激和损伤，并且肛门伤口位置特殊，持续受肠道粪菌的污染，易出现伤口延迟愈合和瘢痕组织形成，引起疼痛、肛管狭窄等后遗症［3］。因此，如何促进肛周创面快速愈合、减少并发症产生，是肛肠术后创面管理的重要问题。中医外治法使药物直达病所而发挥治疗作用［4］，国医大师陈民藩教授经长期的临床总结，研制出用于肛肠疾病外治的中成药紫白膏。紫白膏能够改善肛门术后水肿和疼痛，促进肛门、直肠创面愈合［5-7］，但其具体机制尚不明确。转化生长因子β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）/Smad通路在细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积和填补创口中发挥着重要作用，TGF-β1、Smad3 是其中关键的上下游分子［8-9］。本研究观察紫白膏对大鼠肛周创面TGF-β1、Smad3 的影响，探讨其促愈机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 雄性SD 大鼠40 只，体质量250～300 g，购自杭州医学院动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002。饲养于福建安布瑞生物科技股份有限公司，温度22～26 ℃，湿度60%～70%，光照12 h/d，许可证号：SYXK（闽）2022-0002。

1.2 实验药物 紫白膏（福建中医药大学附属人民医院院内制剂，批准号：闽药制字Z06106031，批号：220210），主要由大黄、紫草、白及、冰片、煅石膏等组成；凡士林（振德医疗用品股份有限公司，批号：202210235A）；0.9%氯化钠注射液（福州海王福药制药有限公司，批号：220214044）。

1.3 实验试剂 RIPA 强裂解液（大连美仑生物技术有限公司，批号：MA0151）；苯甲基磺酰氟（江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：KGP610）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo 公司，批号：23209）；超敏化学发光检测试剂盒（上海百赛生物技术股份有限公司，批号：S6009M）；十二烷基硫酸钠（德国Merck 公司，批号：151-21-3）；β-actin、TGF-β1 抗体（美国Proteintech 公司，批号：66009-1-Ig、21898-1-AP）；Smad3 抗体（北京博奥森生物科技有限公司，批号：bs-3484R）。

1.4 实验仪器 超低温冷冻储存箱（合肥中科美菱低温科技股份有限公司）；低速迷你离心机（湖南湘仪检测试验设备有限公司）；微量冷冻离心机（美国Beckman 公司）；荧光定量PCR 仪（美国Thermo公司）；PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）；超微量紫外可见光分光光度计（北京百泰克生物技术有限公司）；低温研磨机（上海净信实业发展有限公司）。

2 方 法

2.1 分组及造模 将40 只SD 大鼠适应性喂养3 d，随机分为空白组、模型组、对照组和紫白膏组，每组10 只。各组SD 大鼠参考文献［10］建立大鼠肛周创面模型。10%水合氯醛按3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉后，用镊子、剪刀于大鼠肛门周围部位修剪直径约为2 cm 的正圆形切口，逐层剪开肛周皮肤的表皮、筋膜直至肌层，止血，以油纱、胶带固定伤口。除空白组外，其余各组换药前0.5 h 在创面上滴加粪便提取液1 mL（取健康人新鲜粪便10 g＋生理盐水5 mL，混匀，离心，取上清）。

2.2 干预措施 空白组和模型组均予生理盐水纱条湿敷，对照组予凡士林外敷，紫白膏组予中药紫白膏涂覆创面。具体方法：使用棉签沾取药物，完整覆盖创面，层厚约1 mm。各组干预后予清洁敷料覆盖，外用胶布固定。每日换药1 次，连续换药14 d，10%水合氯醛按3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉，以肛周创面为中心沿创缘剪取组织标本，标记后于-80 ℃冰箱冻存。

2.3 创面愈合率检测 采用心电图网格纸（1 小格1 mm）测量大鼠干预前后肛周创伤面积，计算其创面愈合率。

2.4 Western blot 检测大鼠肛周创面组织TGF-β1、Smad3 蛋白表达量 取大鼠肛周创面组织经裂解液裂解，匀浆后离心取上清液，BCA 法检测蛋白浓度。经SDS-PAGE 电泳及转膜后，5%脱脂牛奶封闭1 h。加一抗β-actin（1∶8 000）、TGF-β1（1∶3 000）、Smad3（1∶2 000），4 ℃摇床过夜。TBST 溶液清洗，加入二抗稀释液（1∶5 000）孵育2 h，显影后用ImageJ 软件检测条带的灰度值。

2.5 qPCR法检测大鼠肛周创面组织TGF-β1、Smad3 mRNA 相对表达水平 取大鼠肛周创面肉芽组织以Trizol 法裂解RNA，通过逆转录试剂盒逆转录为cDNA。引物由福州尚亚生物技术有限公司合成，引物序列见表1。以GADPH 为内参，应用SYBR 试剂盒以三步法进行qPCR。反应体系：cDNA 2 μL，2 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，SYBR 10 μL，ddH2O 6.8 μL，DyeⅠ 0.4 μL。反应条件：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，扩增40 个循环。扩增结束后，根据每次循环延伸处收集的荧光信号，采用2-ΔΔCt值对基因进行相对定量。

2.6 统计学方法 采用SPSS 26.0 软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 4 组肛周创面愈合率比较 与空白组比较，模型组大鼠肛周创面愈合率明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，紫白膏组和对照组大鼠肛周创面愈合率均明显提高（P均＜0.05）；与对照组比较，紫白膏组大鼠肛周创面愈合率明显提高（P＜0.05）。见表2。

表2 4 组肛周创面愈合率比较（±s） %

表2 4 组肛周创面愈合率比较（±s） %

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05；与对照组比较，3） P＜0.05。

创面愈合率87.72±3.29 73.32±2.201）78.12±3.922）84.60±1.992）3）组别空白组模型组对照组紫白膏组n 10 10 10 10

3.2 4 组肛周创面组织TGF-β1、Smad3 蛋白表达量比较 与空白组比较，模型组大鼠肛周创面组织TGF-β1、Smad3 蛋白表达量均明显提高（P均＜0.05）；与模型组比较，紫白膏组和对照组大鼠肛周创面组织TGF-β1、Smad3 蛋白表达量均明显降低（P均＜0.05）。见图1、表3。

表3 4 组肛周创面组织TGF-β1、Smad3 蛋白表达量比较（±s）

表3 4 组肛周创面组织TGF-β1、Smad3 蛋白表达量比较（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

Smad3 0.36±0.04 0.98±0.111）0.61±0.092）0.56±0.092）组别空白组模型组对照组紫白膏组n 10 10 10 10 TGF-β1 0.41±0.03 1.07±0.071）0.63±0.062）0.56±0.072）

3.3 4 组肛周创面组织TGF-β1、Smad3 mRNA 相对表达水平比较 与空白组比较，模型组大鼠肛周创面组织TGF-β1、Smad3 mRNA 相对表达水平明显提高（P＜0.05）；与模型组比较，紫白膏组和对照组大鼠肛周创面组织TGF-β1、Smad3 mRNA 相对表达水平均明显降低（P＜0.05）；与对照组比较，紫白膏组大鼠肛周创面组织TGF-β1、Smad3 mRNA 相对表达水平明显降低（P＜0.05）。见表4。

表4 4 组肛周创面组织TGF-β1、Smad3 mRNA相对表达水平比较（±s）

表4 4 组肛周创面组织TGF-β1、Smad3 mRNA相对表达水平比较（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05；与对照组比较，3） P＜0.05。

Smad3 1.00±0.07 1.85±0.041）1.51±0.032）1.37±0.072）3）组别空白组模型组对照组紫白膏组n 10 10 10 10 TGF-β1 1.00±0.08 1.99±0.051）1.38±0.012）1.21±0.012）3）

4 讨 论

紫白膏质地细腻，可减少患处创面摩擦，降低患者在愈合过程中的不适感，保护创面，加速愈合，并有助于改善肛肠疾病局部并发症。紫白膏含有大黄、紫草、白及、煅石膏、冰片等中药，具有清热、凉血、生肌等功效。其中大黄、紫草为紫白膏的君药，可清热、解毒、凉血；白及、煅石膏为臣药，可收敛止血、消肿生肌；辅以冰片宣毒防腐、清热止痛。前期研究发现，紫白膏可通过调控肛周创面模型大鼠血浆IL-6、IL-10 水平实现术后镇痛、凝血［11］，并且有效提高碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达并促进大鼠创面的修复［6］。

肛门创面的修复是动态的过程，需要在快速愈合与瘢痕增生的矛盾点中取得平衡，既满足外科快速康复理念，又避免不良愈合带给患者心理和经济负担。在肛门修复的早期，免疫细胞进入损伤区域，释放出生长因子，使创面周围细胞增殖、移动与分化［12-13］。在创口填充的过程中，随着ECM 的沉积，局部坏死组织被溶解和吸收，肉芽组织逐渐转变为以胶原纤维为主的瘢痕［14］。在以上过程中，细胞因子通过信号传递发挥着免疫调节、刺激细胞增殖的重要作用［15-16］。

TGF-β1/Smad 通路的动态调节影响着创面的良性或不良愈合［17-18］。TGF-β1 是转化生长因子家族中的主要成员之一，可促进成纤维细胞增殖以及ECM 沉积，TGF-β1 与跨膜受体结合，激活下游分子产生级联效应［19-20］。Smad3 是TGF-β1/Smad 信号通路下游的信号传递分子［21］，它可被受体样活化性激酶5（ALK5）磷酸化并介导胞外刺激传递到核内，通过调控基质金属蛋白酶1（MMP-1）的合成参与调节ECM［22］。在病理性状态下，TGF-β1 对膜受体的激活可引起Smad3 的表达上调，从而导致瘢痕增生［23］。研究表明在增生性瘢痕（hypertrophicscar，HTS）的典型不良愈合状态下，TGF-β1 mRNA 表达水平和蛋白表达明显高于正常皮肤［24］。因此创面良性愈合与TGF-β1、Smad3 的合理表达具有密切关系。在大鼠创面治疗后14 d，属于创面愈合的肉芽增生末期或上皮化期，此时由于TGF-β1/Smad 通路的激活，创面的胶原和纤维蛋白增加，从而加速创面填充，容易产生瘢痕的过分堆积。因此，此阶段的药物干预及关键分子检测对于临床具有意义。

本研究结果显示，紫白膏组的创面愈合率与空白组比较差异无统计学意义，且明显高于模型组和对照组，表明使用紫白膏治疗后，大鼠肛周创面的愈合情况与未受粪便菌群污染的空白组类似。与空白组相比，模型组治疗第14天创面组织中TGFβ1、Smad3 表达升高，因模型组加入了粪便菌群而未进行有效干预，属于感染伤口，表明TGF-β1、Smad3 的激活可能与创面受炎症刺激后的非良性愈合有关。紫白膏组TGF-β1、Smad3 蛋白表达和mRNA 水平较模型组和对照组明显降低，表明在大鼠肛周创面愈合后期，紫白膏可能通过下调TGF-β 1、Smad3 的表达，减轻创面病理性瘢痕增生以促进创面的良性愈合。

在今后的研究中，需要进一步明确紫白膏对不同创面愈合阶段TGF-β1/Smad 通路上下游分子表达的差异，如紫白膏对大鼠创面基质金属蛋白酶、胶原蛋白等终产物的影响，深入发掘紫白膏的作用机制。