响应面法优化双黄连口服液醇沉物乳酸菌发酵工艺

王清龙，王坤丽，赵圣振，袁琦昱，汤法银*

(1. 河南牧业经济学院，河南 郑州 450046；2. 河南炎黄生物工程有限公司，河南 新乡 453000)

2020年以来中国畜牧业步入“饲料端禁抗、养殖端限抗、产品端无抗”快速推进期，中药作为“替抗”的主力军，也迎来了高质量发展的大好时机[1]。但中药属于资源性产物，加上全球需求逐步增加和养殖成本限制，一定程度上制约着其在畜牧业上的应用发展。而 “不与人药争资源”和“吃干榨净”的系统研发思路[2]，为破除兽用中药资源和价格瓶颈提供了可能。我国现行药典和兽药典中双黄连口服液制法均采用了水提醇沉法[3-4]，其工业化生产过程会产生大量的絮凝废弃沉淀物——双黄连口服液醇沉物，其主要成分为大分子多糖、黏液质、蛋白质等，也包含部分次生代谢活性物如黄酮、生物碱等[5-7]，是潜在的兽用中药开发资源。同时益生菌发酵中药，可利用益生菌降解大分子物质，产生小分子活性成分、代谢产物及活性酶等，因而成为“替抗”产品研发热点[8]。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一类能利用碳水化合物产生乳酸的细菌总称，属于革兰阳性菌，兼性厌氧，不产生芽胞。这类菌广泛分布于自然界中，是人和动物常用益生菌，具有促进消化吸收、维持机体肠道菌群平衡、增强机体免疫力等功能[9]。利用乳酸菌对中药进行发酵，能提高中药的药效，应用于动物能提高动物生产性能和抗氧化能力，调节肠道菌群[10-12]。基于此，本试验选用乳酸菌对双黄连口服液醇沉物进行液态发酵，采用响应面法优化发酵工艺制成发酵中药制剂[13]，不仅能“变废为宝”，推进中药制剂工业废弃物的资源化利用，更拓宽了兽用中药资源，为中兽医药“治未病”的养-调-防-治的健康养殖提供更多可用中药产品。

1 材料与方法

1.1 双黄连口服液醇沉物干粉制备

双黄连口服液醇沉物来自于河南某知名中药制药企业，取适量置 105 ℃烘箱中烘至干燥后粉碎，过4号筛即得(水分≤9.0%)。

1.2 乳酸菌种活化

乳酸菌菌种由河南牧业经济学院发酵中药实验室提供。将放于-20 ℃冰箱中乳酸菌甘油冻存管置室温融化后，划线接种于固体MRS培养基(北京澳博星生物技术有限公司)，37 ℃倒置培养24 h，再将其转接至MRS液体培养基，37 ℃恒温培养箱中厌氧培养24 h后备用，并吸取菌液置于显微镜下进行观察，确定菌种是否恢复活性。

1.3 双黄连口服液醇沉物添加量的确定

分别按每组总质量的10%、20%、30%准确称取双黄连口服液醇沉物加入发酵瓶中，加水后混匀并灭菌，按总质量6%接种乳酸菌，37 ℃恒温培养48 h，每组试验重复3次，以活菌数为指标选取最佳浓度，取平均值作为单因素试验所用底物浓度。

1.4 发酵液中活菌数的测定

采用平板活菌计数法测量其活菌数[14]。

1.5 单因素试验优化发酵条件筛选

以活菌数为指标，以优选的添加量、接种量6%、发酵温度37 ℃和发酵时间48 h为基础方案，按单因素试验分别研究接种量2%、4%、6%、8%，发酵时间12 h、24 h、36 h、48 h，发酵温度27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃对乳酸菌发酵双黄连口服液醇沉物结果的影响，每组试验重复3次，取平均值。

1.6 响应面法优化发酵条件设计

参照单因素试验结果，以接种量(A)、发酵时间(B)和发酵温度(C)3个因素为自变量，以发酵产物活菌数(Y)为响应值，通过 Design-Expert 11.0软件，采用 Box-Behnken设计法[15]，对双黄连口服液醇沉物乳酸菌液态发酵工艺进行响应面优化设计，见表1。

表1 发酵工艺响应面法优化设计与水平

2 结果与分析

2.1 双黄连口服液醇沉物添加量的确定

试验结果如图1所示，当双黄连口服液醇沉物添加量为20%时，接种量6%，37 ℃恒温培养48 h后活菌数平均值最大，为2.2×109CFU/mL，而添加量为10%和30%时活菌数均较低，因此确定单因素试验中所添加的双黄连口服液醇沉物含量为20%。

图1 醇沉物添加量对发酵结果的影响

2.2 单因素试验优化发酵条件

不同接种量、发酵时间和温度对发酵效果的影响如图2、图3和图4所示，3种因素对乳酸菌液体发酵双黄连口服液醇沉物均具有影响，且接种量4%时活菌数最大值可达2.47×109CFU/mL，发酵时间24 h时活菌数最大值可达1.86×109CFU/mL，发酵温度32 ℃时活菌数最大值可达1.95×109CFU/mL。因此单因素试验确定的最佳条件为接种量4%、发酵温度32 ℃和发酵时间24 h。

图2 不同接种量对发酵结果的影响

图3 不同发酵时间对发酵结果的影响

2.3 响应面法优化

2.3.1 回归模型的建立及方差分析

采用响应面法所得发酵试验结果见表2。利用Design-Expert 11.0软件对表2数据进行BBD分析，可以得到接种量(A)、发酵时间(B)和发酵温度(C)对发酵终产物活菌数(Y)的响应值回归方程为：Y=306.80+25.25A+13.31B+7.81C-0.2500AB+1.25AC+1.38BC-135.09A2-37.46B2-28.96C2。

对该回归方程进行方差分析，结果见表3。由表3数据可知，该二次回归模型的F值为123.54，P<0.000 1，说明该回归模型极显著；失拟项P=0.897 8，说明该模型结果可靠。一次项中的接种量(A)、发酵时间(B)和二次项中的A2、B2、C2的P值均小于0.01，说明这几项因素对于最终产物的活菌数影响极为显著，且3个单因素的F值结果可知其影响顺序为：接种量(A)>发酵时间(B)>发酵温度(C)，最佳发酵条件为：接种量4%、发酵时间24 h和发酵温度32 ℃。

表3 回归模型方差分析结果

2.3.2 二次回归模型分析

利用Design-Expert 11.0软件对表3的二次回归模型进行分析，可得接种量(A)、发酵时间(B)和发酵温度(C)3个因素交互影响发酵终产物活菌数的响应曲面图。

由图5可知，接种量(A)和发酵时间(B)交互影响所得图像的等高线趋近于椭圆形且椭圆度较大，其3D图像坡度较陡，说明这2个因素的交互作用对发酵终产物的影响显著。由图6可知，接种量(A)和发酵温度(C)交互影响的等高线为椭圆形，其3D图像坡度陡峭，说明这2个因素的交互作用对发酵终产物的影响特别显著。由图7可知，发酵时间(B)和发酵温度(C)的交互影响所得图像的等高线更近似于圆形并且其3D图像的坡度相较于前两组缓和，等高线近乎圆形，足以见得这两个因素交互作用的影响不如前两组显著，不过仍具有一定的影响。由图5～7可知，发酵终产物的活菌数随着接种量、发酵时间和发酵温度的逐渐递增总体有着上升下降趋势，说明存在发酵终产物活菌数的极值，且交互作用对其发酵结果影响最大的是接种量和发酵温度。

图7 发酵时间和发酵温度交互作用的响应曲面

2.3.3 最佳发酵条件确定

从单因素试验结果表明最佳条件为接种量4%、发酵时间24 h和发酵温度32 ℃时，说明极值点应当存在于附近。利用Design-Expert 11.0软件可以求出发酵终产物活菌数的极值点，结果接种量4.188%、发酵时间26.165 h、发酵温度32.710 ℃条件下，发酵终产物活菌数理论极值上可达到3.03×109CFU/mL。考虑到实际生产过程中条件与工艺限制，将最佳发酵条件修正为接种量4%、发酵时间26 h、发酵温度32.7 ℃。

2.3.4 验证试验

按照优化的最佳条件，在实验室采用10 L发酵罐进行3次平行扩大试验，结果发酵终产物活菌数的平均值为2.98×109CFU/mL，与响应面预测极值相近，证明该优化条件切实可行。

3 讨论

3.1 中药提取制剂废弃物开发利用

中药提取后，药渣中残留30%的活性成分[16]。我国中药制药产业化过程中，每年产生固体、液体废弃物及副产物达数亿吨，造成中药资源的严重浪费，也对生态环境带来巨大压力。基于此，段金廒等[2]提出 “吃干榨净、物尽其用”的中药资源循环利用原则，构建了中药资源全产业链废弃物及副产物的四级分类体系，并提出药用、饲料化、肥料化等多途径资源化模式。秦梦等[17]在系统研究的基础上，提出中药废渣在畜禽饲料及添加剂生产等方面具有极大的开发应用潜能，并呼吁相关部门加大中药废渣的综合开发利用，以减少污染保护生态环境，同时实现中药产业的良性循环发展。研究表明，中药提取制剂工业废弃物——醇沉物，含有大量的营养物质和部分免疫活性物质，主要是植物多糖、蛋白质及次级代谢产物[5，18]，具有综合开发利用价值。植物多糖具有促生长、提高免疫力、抗氧化功能，同时作为益生元能调节肠道菌群和肠道组织形态[19-21]。汤法银等[22]选用当归补血口服液制剂的废弃醇沉物添加在雏鸡日粮中，结果与对照组比较，添加醇沉物组的雏鸡各方面生长指数及抗体效价均有显著提高。张丽霞[23]研究发现板蓝根水提醇沉物干物质中含有总糖 52.49%，蛋白质13.19%，益生菌发酵后在肉鸡饲粮中添加，可显著提高肉鸡平均日增重，降低料重比，同时增强免疫力。随着研究的深入，水提醇沉法为主制备的多种中药多糖被证实具有免疫增强等生物活性，并在畜牧业上得到广泛应用[24-25]，进一步提示中药提取制剂的醇沉物存在较大的开发潜力。

3.2 影响发酵的因素及条件优化

益生菌发酵中药与多种因素相关，发酵菌种及数量、发酵温度、时间、湿度、氧气等受环境影响较大[26-28]。本研究单因素试验和响应面法回归模型均表明，接种量对发酵结果影响显著，但也并非越多越好，随着接种量的增加，发酵产物活菌总数反而逐渐下降，其原因可能是因为双黄连口服液醇沉物所提供的的营养物质会被乳酸菌用来进行呼吸和繁殖，当菌种数量达到一定时就出现了饱和状态，双黄连口服液醇沉物所提供的营养物质不足以供养如此数量的菌种，菌种的生长繁殖也会受到抑制，也就是菌种数量超出了底物所能提供的最大限度，不仅发酵结果不佳，还会造成一定程度上的浪费。响应面法回归模型表明，接种量、发酵时间和发酵温度对发酵终产物活菌总数的影响都极为显著，且3个单因素的F值表明其对发酵终产物活菌数的影响顺序为：接种量(A)>发酵时间(B)>发酵温度(C)。然而，利用Design-Expert 11.0软件进行二次回归模型进行分析可知：三因素交互作用对发酵结果影响最大的是接种量和发酵温度，而发酵时间和发酵温度的交互作用基本不显著；同时单因素试验优化最佳条件和响应面法计算极值条件相近，3次平行扩大验证试验也表明优化条件可行，因此在发酵条件优化时要充分考虑发酵过程是多种因素互作结果，在科学设计基础上应充分考虑实际生产条件，实现发酵工艺的效益最大化。

4 结论

本试验表明，乳酸菌液态发酵双黄连口服液醇沉物的最佳条件为：醇沉物添加量20%、接种量4%、发酵温度32.7 ℃、发酵时长26 h。3次平行扩大试验所得发酵终产物活菌数的平均值为2.98×109CFU/mL。在此条件下利用乳酸菌对双黄连口服液醇沉物进行发酵，制备发酵中药制剂，不仅能变废为宝，避免了中药制剂工业废弃残渣对环境造成的污染，也为其合理开发应用提供了新思路，更为畜牧业健康养殖提供了更多绿色、低廉、有效的中药或饲料添加剂产品。