腹腔注射GnIH对瑶鸡卵巢糖代谢的影响

韩东洋，刘澄澄，徐畅临，张鑫，宋星星，张佳妮，沈冰茜，辛园园，张凌源，李珣

(广西大学动物科学技术学院/广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心/广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室/广西高校动物疫病预防与控制重点实验室，广西 南宁 530004)

大量研究证实雌性动物的生殖功能与能量代谢息息相关，能量代谢的不同状态可直接影响动物的生殖活动[1-2]。随着神经内分泌研究的发展，人们发现多种神经肽不仅参与动物的生殖活动和能量代谢，而且作为能量代谢信号调控动物的生殖功能[3-4]。2000年，Tsutsui等[5]在鹌鹑的下丘脑中发现了一种由12种氨基酸组成的神经肽，命名为促性腺激素抑制激素(GnIH)。大量研究证实GnIH在下丘脑、垂体和性腺水平均可参与动物的生殖调控[6]。有研究证明GnIH在卵巢水平参与动物的生殖调控，尤其影响卵巢颗粒细胞的生理功能，但其具体调控机制尚未完全明确[7-9]。

随着GnIH生理功能研究的深入，发现GnIH还参与摄食、应激和能量代谢等多种生理活动。2005年，Tachibana等[10]给鸡侧脑室注射GnIH后发现能够显著增加动物的摄食量，推测GnIH可能是下丘脑中一种新型促食欲素。随后，其他研究人员在羊、小鼠及猕猴上也得到相似的结论[11]。Benton等[12]研究发现GnIH促进动物摄食，并显著升高脂肪中葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)表达和甘油三酯(TGs)的含量，抑制睾丸中葡萄糖转运蛋白8(GLUT8)和胰岛素受体的表达，同时显著降低血清中睾酮含量。因此我们推测GnIH可能是联系动物生殖与能量代谢的一种新型调控因子，并猜测GnIH可能通过调控卵泡的糖代谢影响卵巢的生殖功能。

本研究以广西特色的瑶鸡作为研究对象，研究GnIH对瑶鸡卵巢葡萄糖摄入、糖酵解和三羧酸循环(TCA)过程的影响。期望通过本研究证实GnIH是一种新型的能量代谢调控因子，从而进一步完善GnIH生理功能，并为探究能量代谢异常导致卵巢功能障碍提供新的突破口。

1 材料与方法

1.1 试验动物及分组

南丹瑶鸡10只，雌性，180日龄，体重(1 700±100)g，购自南宁禽苗市场。瑶鸡适应性饲养1周后，随机分为2组，其中对照组注射0.9%生理盐水，每次0.1 mL/只；GnIH组注射24.54 μg/kg GnIH，每次0.1 mL/只，每天注射2次(7：00和19：00)，连续2周。

1.2 主要仪器及试剂

反转录试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司；葡萄糖(GLU)试剂盒、丙酮酸测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

GnIH购自生工生物工程(上海)科技有限公司；糖代谢相关基因葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸果糖激酶(PFK)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、乳酸脱氢酶B(LDHB)和琥珀酸脱氢酶B(SDHB)引物均由北京擎科生物科技有限公司设计及合成，详见表1。

表1 引物信息

1.3 采食模式监测

瑶鸡在恒定光照(12 h光照、12 h黑暗)和温度(25±2)℃的条件下饲养，自由采食和饮水。分别记录2组每天光照和黑暗条件下的采食量，每2 d记录注射后1、2、4和8 h采食量。

1.4 脏器指数检测

最后一次注射15 min后，将瑶鸡颈动脉放血处死，取出卵巢并称重，计算卵体比(卵巢重量/体重)。

1.5 葡萄糖和丙酮酸含量检测

收集卵巢，称重后于液氮速冻，储存在-80 ℃备用。将卵巢组织研磨，按照测定试剂盒说明书进行操作测定葡萄糖和丙酮酸的含量。

1.6 荧光定量RT-PCR检测基因mRNA表达水平

按照TRIzol法提取各组卵泡总RNA，反转录获得cDNA。采用荧光定量RT-PCR的方法检测mRNA的表达情况。qPCR反应体系为20 μL，其中10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR 酶溶液、8 μL ddH2O、0.5 μL Primer 1、0.5 μL Primer 2和1 μL Template cDNA。反应程序为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt计算所检测基因mRNA的相对表达量。

1.7 数据统计与分析

试验结果采用SPSS 20.0软件进行独立样本t检验进行评估，并进行显著性检验，P<0.05被认为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 GnIH对瑶鸡表观指标的影响

2.1.1 GnIH对瑶鸡采食量的影响

由图1可知，与对照组相比，腹腔注射GnIH后瑶鸡的采食量增多。其中，注射GnIH后1、2、4、8 h瑶鸡的采食量均显著增加(P<0.05)，提示腹腔注射GnIH可引起瑶鸡采食量的增加。

注：*表示P<0.05。下同。

由图2所示，与对照组相比，腹腔注射GnIH后瑶鸡的夜间平均采食量极显著升高(P<0.01)。

注：**表示P<0.01。下同。

2.1.2 GnIH对瑶鸡卵巢脏器指数的影响

由图3可知，与对照组相比，腹腔注射GnIH后瑶鸡的卵体比显著降低(P<0.05)。

2.2 GnIH对卵巢糖代谢的影响

2.2.1 GnIH对瑶鸡卵巢组织葡萄糖摄入的影响

由图4可知，腹腔注射GnIH后，瑶鸡GLUT1和GLUT3基因mRNA的表达量极显著上升(P<0.01)，但卵巢组织中葡萄糖含量没有显著差异。

图4 GnIH对卵巢GLUT1(A)、GLUT3(B)表达量和葡萄糖(C)含量的影响

2.2.2 GnIH对瑶鸡卵巢组织葡萄糖酵解的影响

由图5可知，腹腔注射GnIH后可使卵巢中糖酵解关键限速酶PK和PFK基因mRNA的表达量显著上升(P<0.05)，卵巢组织中LDHA基因mRNA的表达量显著升高(P<0.05)，而LDHB基因mRNA的表达量显著下降(P<0.05)。

图5 GnIH对糖酵解相关基因mRNA表达量的影响

2.2.3 GnIH对瑶鸡卵巢组织线粒体能量代谢的影响

由图6可知，腹腔注射GnIH后，瑶鸡卵巢组织中线粒体能量代谢的底物丙酮酸含量显著上升(P<0.05)，而线粒体能量代谢和TCA循环中关键酶SDHB的表达量显著下降(P<0.05)。

图6 GnIH对瑶鸡卵巢组织线粒体能量代谢的影响

3 讨论

近年研究证明，GnIH可以影响机体的采食并可能参与能量代谢[13-14]。Tachibana等[10]首次报道了GnIH作为一种新的促食欲肽，能促进鸡的采食。McConn等[15]通过脑室内注射(ICV)给药也观察到GnIH可增加不同品系鸡食物摄入的结果。先前研究证明慢性腹腔注射GnIH会导致小鼠发生胰岛素抵抗，采食量增加，进而引起小鼠糖代谢紊乱[16 ]。以上研究与本试验的结果一致，腹腔注射GnIH可导致瑶鸡的采食量增加，猜测食物摄入异常能够引起能量代谢的紊乱。糖代谢的改变对卵巢的发育产生有害影响[17]。GnIH与母鸡的卵巢退化有关[18-19]，本研究发现腹腔注射GnIH会导致瑶鸡卵巢脏器指数显著降低，证实了该结论。

卵巢发育所需的能量主要来源于TCA循环[20]。丙酮酸含量升高，表明卵巢颗粒细胞的代谢模式发生了变化[21]。本研究发现，腹腔注射GnIH会导致丙酮酸含量升高，TCA循环关键酶(SDHB)的表达量显著下降。Mao等[22]在线粒体功能损伤的卵巢颗粒细胞中发现葡萄糖消耗明显增高，糖酵解活性增强。糖酵解和氧化磷酸化是细胞葡萄糖代谢的主要途径和主要的能量来源。然而，在卵母细胞中，葡萄糖转运蛋白和磷酸果糖激酶的表达水平极低，表明卵母细胞很少直接消耗葡萄糖作为代谢底物[23]。本研究结果表明，腹腔注射GnIH可导致卵巢内葡萄糖转运蛋白GLUT1、GLUT3和糖酵解相关酶PK、PFK、LDHA、LDHB的表达增加，提示腹腔注射GnIH可引起TCA循环异常并增加卵巢糖酵解的活性。

4 结论

本研究探讨了腹腔注射GnIH对瑶鸡采食和卵巢糖代谢的影响，结果提示腹腔注射GnIH可增加瑶鸡的采食量，导致瑶鸡卵巢葡萄糖转运的加快，促进糖酵解的发生，TCA循环异常和丙酮酸的积累，引起卵巢糖代谢紊乱，进而导致卵巢发育异常。