地稔预干预对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后炎症因子表达的影响

陈科 李晓飞 王济纬

脊髓缺血再灌注损伤（spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII）是脊髓缺血损伤一段时间后，相应节段血供恢复，神经功能却在原损伤基础上进一步加重[1]。目前，炎症反应被认为是造成SCII 的最重要的因素之一[2,3]。甲强龙可通过减轻损伤脊髓炎症反应保护受损神经，但大量使用后并发症较多。地稔是一种传统的药用植物，其抗炎，抗氧化等作用在现代药理研究中逐渐被证实，相关研究发现其可通过降低肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）的表达减轻缺血肢体的再灌注损伤[4,5]。本次研究建立大鼠脊髓缺血再灌注模型，探讨地稔预干预对SCII大鼠脊髓组织中炎症因子表达变化的影响。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂 本次研究时间为2018 年6 月至2018年10 月，选择清洁级健康成年雄性SD大鼠72只，鼠龄6～8 周，体重（138.24±11.12）g，购自上海斯莱克动物实验中心。实验动物许可证号为[SYXK（浙）2015-0009]。本次研究经温州医科大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 实验分组 按照随机数字表法将大鼠分为假手术组（Sham 组）、缺血-再灌注组（SCII 组）、地稔干预组（MD组）、甲强龙治疗组（MP组），每组18只。

1.3 模型制备与标本采集 MD 组于术前7 d 开始灌胃地稔水煎液，浓度0.2 g/ml，每次剂量10 ml/kg，每日1 次，连续7 d。SCII 组、MP 组与Sham 组予等量生理盐水灌胃，每日1 次，连续7 d。7 d 后SCII组、MD组大鼠用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，腹部向上固定操作台上，常规消毒。取腹部正中切口进入腹腔，仔细暴露出腹主动脉，于左肾动脉分支上，右肾动脉分支下，用血管夹夹闭腹主动脉，显微镜下确认夹闭下方血管无血供。45 min 后取下血管夹，恢复血流，逐层缝合切口。MP 组予术前30 min 经舌下静脉注射甲强龙后同样方法建立SCII 模型。分别在再灌注后6 h、48 h、72 h 再次将大鼠深麻醉。四组各时间点取6只大鼠深麻醉后在冰上快速取下同上位置脊髓组织，放入冻存管中于-80 ℃中保存。

1.4 观测指标

1.4.1 大鼠后肢功能BBB 评分 三名研究者分别在SCII 建模成功后6 h、48 h、72 h 对四组大鼠后肢运动功能进行盲法评分，采用Basso、Beattie和Bresnahan（BBB）评分标准。

1.4.2 酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）检测脊髓组织中TNF-α、IL-6、白细胞介素10（interleukin-10，IL-10）表达水平 将脊髓组织称质量后置于冰上融化，取100 mg，按照RAPI 裂解液说明书按比例加入裂解液研磨，离心，取上清液待测，严格按ELISA试剂盒（由联科生物生产）说明书操作。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件进行数据统计分析，计量数据以均数±标准差（）表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。设P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠再灌注损伤后不同时间点后肢BBB评分比较见表1

表1 四组大鼠再灌注损伤后不同时间点后肢BBB评分比较/分

由表1可见，四组大鼠再灌注损伤后6 h、48 h、72后肢BBB评分比较，差异均有统计学意义（F分别=158112.03、4439.19、6363.55，P均＜0.05）。进一步两两比较，SCII组再灌注损伤后6 h、48 h、72 h后肢BBB 评分明显低于Sham 组（t分别=26.78、12.54、11.59，P均＜0.05）。再灌注损伤后6 h，MD组和MP组与SCII 组比较，差异均无统计学意义（t分别=0.75、1.14，P均＞0.05），再灌注损伤后48 h、72 h，MD 组和MP 组大鼠后肢BBB 评分均高于SCII 组（t分别=10.25、8.56；15.47、11.62，P均＜0.05）。MD 组与MP 组各时间点BBB 评分比较，差异均无统计学意义（t分别=0.34、0.94、1.03，P均＞0.05）。

2.2 四组大鼠再灌注损伤后不同时间点脊髓组织中TNF-α表达变化见表2

表2 四组大鼠再灌注损伤后不同时间点脊髓组织中TNF-α表达变化/ng/ml

由表2 可见，四组大鼠再灌注损伤后不同时间点脊髓组织中TNF-α表达比较，差异均有统计学意义（F分 别=10799.34、2224.49、8338.45，P均＜0.05）。进一步两两比较，SCII组各时间点TNF-α表达均高于Sham组（t分别=20.34、25.86、22.17，P均＜0.05），MD 组和MP 组各时间点TNF-α 表达低于SCII 组（t分 别=12.18、17.20、12.74；14.53、16.32、21.15，P均＜0.05），再灌注损伤后48 h、72 h，MP 组TNF-α表达均低于MD组（t分别=9.63、10.36，P均＜0.05）。

2.3 四组大鼠再灌注损伤后不同时间点脊髓组织中IL-6表达变化见表3

表3 四组大鼠再灌注损伤后不同时间点脊髓组织中IL-6表达变化/ng/ml

由表3 可见，各组大鼠再灌注损伤后不同时间脊髓组织中IL-6表达比较，差异均有统计学意义（F分别=628.50、1401.99、1115.35，P均＜0.05）。进一步两两比较，SCII组各时间点IL-6表达均高于Sham组（t分别=26.74、27.66、25.69，P均＜0.05），MD组和MP 组IL-6 表达低于SCII 组（t分别=11.79、12.35、13.41；13.14、15.66、16.77，P均＜0.05）。再灌注损伤后48 h、72 h，MP 组IL-6 表达低于MD 组（t分别=10.63、9.88，P均＜0.05）。

2.4 四组大鼠再灌注损伤后不同时间点脊髓组织中IL-10表达变化见表4

表4 四组大鼠再灌注损伤后不同时间点脊髓组织中IL-10表达变化/ng/ml

由表4 可见，四组大鼠再灌注损伤后不同时间点脊髓组织中IL-10 表达变化比较，差异均有统计学意义（F分别=627.34、228.75、809.65，P均＜0.05）。进一步两两比较，SCII 组各时间点IL-10 表达均高于Sham 组（t分别=12.40、12.96、14.27，P＜0.05），MD 组和MP 组IL-10 表达高于SCII 组（t分别=8.53、11.26、7.74；10.25、12.17、13.13，P均＜0.05），再灌注损伤后48 h、72 h，MP 组IL-10 表达高于MD组（t分别=-6.01、-8.61，P均＜0.05）。

3 讨论

SCII 由一系列复杂的酶联反应介导发生，目前相关损伤机制研究主要包括炎症应激反应、离子环境失衡、细胞凋亡等，其中炎症反应被视为最重要的机制之一，研究表明血流再灌注后激发黏附分子和趋化因子表达引起包括白细胞募集、血管内皮损伤、神经毒性等一系列炎症反应[6～8]。

当前针对SCII 后抑制炎症反应的治疗，临床上应用最广的是甲强龙，但近来研究对其改善神经功能预后存在广泛争议，同时大剂量甲强龙使用所带来的一系类并发症也限制了其应用，能否在传统民族药物中寻找新的治疗契机逐渐成为新的热点[2，3]。地稔长期被瑶族、苗族和畲族等几个少数民族广泛应用于治疗各种不同的疾病。主要以全草煎熬口服为主，从地稔水煎液中分离出109 种化合物，包括有机酸、黄酮类、多糖、氨基酸和类固醇，现代药理研究中逐渐证实其具有止血、镇痛、抗炎、抗氧化和抑制高级糖基化终产物的形成等作用[9,10]。既往研究显示经过地稔水煎液预处理可以降低大鼠肢体缺血再灌注损伤后炎症因子TNF-α和IL-6的表达水平，从而达到减轻炎症反应，保护缺血肢体的作用[5]。基于以上证据，本次研究进一步探讨地稔对SCII损伤神经组织炎症因子表达的影响，结果显示，SCII 组、MD 组、MP 组大鼠后肢BBB 评分均低于Sham 组（P均＜0.05），另外再灌注后48 h、72 h MD组、MP 组大鼠后肢BBB 评分均高于SCII 组（P均＜0.05），而MP组各时间点BBB评分并未明显高于MD组（P＞0.05），表明地稔与甲强龙预处理均可减轻SCII 损伤引起的双下肢神经功能障碍，且地稔治疗效果与甲强龙治疗效果相当。

TNF-α是嗜中性粒细胞有效的激活剂，通常与细胞膜上的p55与p75两个受体结合，不论在大鼠、新西兰兔亦或是猪的SCII 模型研究中均可观察到再灌注损伤后TNF-α增高，不同模型呈现不同的增高幅度，大体呈现一个双向趋势[11]。IL-6可由单核-巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞产生，其通过产生急性期反应蛋白参与炎症反应，而在不同的SCII 损伤模型中均可发现再灌注损伤后IL-6呈现高表达趋势[12]。IL-10是一种有效的抑炎因子，研究表明在大鼠SCII损伤后48 h IL-10在脊髓灰质呈现出高表达状态，IL-10 可以通过抑制髓过氧化物酶表达减轻炎症反应[13]。本次研究结果显示，与Sham 组比较，其余三组脊髓组织中TNF-α、IL-6 和IL-10表达均出现增高趋势，MD组、MP组促炎因子TNF-α、IL-6表达较SCII组低，MP组表达相对最少；MD 组、MP 组抑炎因子IL-10 均高于SCII 组，MP 组表达最高，以上结果表明地稔及甲强龙预干预在SCII 后均可抑制炎症过度表达，起到保护脊髓组织的作用，但地稔对于脊髓组织内炎症反应抑制水平不及甲强龙，如何提高地稔疗效有待进一步研究。

综上所述，地稔可以通过抑制促炎症因子、提高抑炎因子的表达，减少中性粒细胞浸润等减轻炎症反应，从而对大鼠SCII 损伤产生保护作用，但整体疗效不如甲强龙。另外，本次研究仅是研究预处理，有待开展SCII 损伤后地稔治疗的进一步研究，同时本次研究地稔为中药制剂，其中成分未经提纯，如何提高地稔药效有待进一步研究。