杧果果皮蜡质结构对果实抗炭疽病的影响

刘 然,吴婧波,徐永艳,詹儒林,柳 凤,姚全胜,李国平,魏 卿

(1 西南林业大学园林园艺学院,昆明,650224;2 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/海南省热带园艺产品采后生理与保鲜重点实验室/农业部热带果树生物学重点实验,广东湛江,524091;3 中国热带农业科学院海口实验站,海口,571101;4 中国热带农业科学院三亚研究院,海南三亚,572025)

杧果炭疽病是杧果采前和采后主要病害之一,主要由杧果胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides引起,在我国海南、广东、云南和四川等主产地造成严重的经济损失[1-2]。我们前期观察和研究发现,田间存在丰富的抗感炭疽病杧果种质资源[3],且抗感病品种与普通品种的果皮结构存在明显差异[4]。

果皮在果实抵抗病原侵染过程中发挥着积极作用。而蜡质是果皮角质层的重要组成部分,分为具有一定晶体结构的外蜡和由蜡膜覆盖、镶嵌在外部角质的无定形内蜡。外蜡是果皮与环境接触的第一道屏障,其独特结构在抵抗病菌侵染过程中表现出一定的物理性阻碍。研究结果表明,蓝莓[5-6]、秋子梨[7]果实表面蜡质被破坏后,其衰老加速,病菌侵染严重;芝麻斑病菌侵染番茄叶片过程中,蜡质主要发挥物理阻碍作用[8];大麦叶片蜡质被去除后,有更多锈菌附着孢形成[9];苹果经过热处理后,蜡质裂纹愈合,对病原菌的抵抗力明显提高[10-13]。

植物蜡质的三维晶体结构分为线状、片状、颗粒状、板状等26种,大小介0.2～100.0 μm之间,需要借助扫描电子显微镜(SEM)观察[14]。不同物种,同物种不同品种,同品种不同生长环境的蜡质晶体结构不同[15],在植物抗病过程中也发挥着不同作用。本研究采用胶孢炭疽菌孢子悬浮液无伤接种的方法分析20个杧果品种脱蜡处理前后抗病情况,并利用扫描电子显微镜观察其表皮蜡质结构变化,探究杧果果皮蜡质结构在抗炭疽病过程中的作用,为研究杧果抗炭疽病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

中国热带农业科学院南亚热带作物研究所园艺产品保鲜与加工研究室分离鉴定保存的杧果炭疽病病原菌胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides供试,编号W1,其孢子悬浮液制备参考李志伟等[16]的方法。

2022年7—8月从杧果产区采集20个杧果品种,其中“热农1号”“金香杧”“汤米06”“咖喱杧”“椰香”“金百花”来自四川省攀枝花市,“玉文”“桂热杧82号”“红象牙”“澳杧”“红凯特”“板蒂”“金星”“肯特”“鹰嘴”“金煌”“贵妃”“台牙”“凯特”“海顿”来自云南省华坪县。每个品种从东南西北4个方向随机采摘成熟度一致、无病斑、无损伤果实各70个。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 每个杧果品种随机选取果实60个,用清水冲洗晾干后随即分为两组,一组为不脱蜡处理,另一组进行蓝丁胶粘连脱蜡处理,两个处理再分别设置无伤接种病菌和无菌培养液处理,具体接种方法为每个果实表面接种胶孢炭疽菌孢子悬浮液(1×106个/mL)或无菌培养液各20 μL,均接种2个点,并润湿棉球保湿,放置于接种盒中,室温26～28 ℃下培养。观察果实发病情况,接种2 d和6 d分别调查各处理发病率、病斑直径,并拍照,参考刘羽等[17]的方法计算病情指数。

1.2.2 果皮蜡质结构观察 各品种样品采摘后用清水缓流冲洗,尽量减小牵拉、挫伤与挤压等机械损伤,在果实赤道周围,用无菌手术刀片切取果皮长2.0 mm、宽1.0 mm、厚1.0 mm样本后,立刻用2.5%戊二醛固定,pH值7.4 0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3次,每次15 min,再依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%乙醇各脱水1次,每次15 min,用乙酸异戊酯脱去乙醇3次,每次15 min;样本放入临界点干燥仪Quorum K850内干燥,用HITACHI MC1000型离子溅射仪镀金膜,最后用Regulus 8100 型扫描电子显微镜观察拍片。

1.2.3 数据处理 使用Excel 2019和SPSS 26.0统计与分析数据。

2 结果与分析

2.1 炭疽病发生情况

从表1和图1可以看出,不脱蜡处理中,接种病菌孢子悬浮液2 d后,热农1号发病率最低,为26.67%,病情指数为19.74;鹰嘴、红凯特、金香杧、板蒂、台牙、澳杧、贵妃、汤米06、金煌、桂热杧82号和玉文发病率在33.33%～56.67%之间,病情指数介于23.07～39.23之间。红象牙等7个品种的发病率最高,达到100%;其中椰香、金星、肯特病情指数介于46.41～51.79之间,金百花、凯特、咖喱杧、红象牙病情指数均大于60。脱蜡处理中,除了发病率100%的品种外,红凯特、贵妃、海顿接种2 d发病率与对照(不脱蜡)相同,其他品种接种2 d发病率均比对照(不脱蜡)升高。说明杧果果皮蜡质被破坏后,炭疽菌对部分品种杧果的侵染速度加快。接种后6 d,所有供试杧果品种发病率均达到100%,但病斑直径不同,热农1号、金香杧、板蒂、澳杧、汤米06、金煌、玉文、椰香、金星、红象牙等10个杧果品种脱蜡处理的病斑直径较对照(不脱蜡)极显著增加,说明脱蜡处理的杧果对炭疽病抗性显著降低。脱蜡处理中,除鹰嘴、红凯特病情指数与对照(不脱蜡)相同外,其他品种病情指数均较对照(不脱蜡)增加,说明脱蜡处理的杧果感染炭疽病后发病程度更重。

图1 4个杧果品种果皮脱蜡处理后接种胶孢炭疽菌孢子悬浮液(1×106个/mL)6 d的发病情况

2.2 果皮蜡质结构的变化

试验结果可以看出,杧果表皮蜡质以不规则血小板状晶体结构为主,排列紧凑,密度较大,并且在其上会融合叠加形成片层状蜡质膜。与不脱蜡处理相比,脱蜡处理后热农1号果实表皮蜡质层状结构被破坏,表面孔隙增多,片状蜡质层结构明显减少(见图2);汤米06果实表皮蜡质的连续性较差,蜡质层状结构上缝隙与孔洞较多,不规则血小板状晶体结构被破坏,部分晶体结构有下凹(见图3);椰香果实表皮蜡质层的连续性较好,但蜡质表面孔洞与缝隙明显,表面蜡质层状结构被严重破坏,不规则血小板状结构并未发生显著变化(见图4);红象牙果实表皮蜡质层的连续性好,孔隙与缝隙最多,蜡膜结构虽被破坏,但蜡质结构无显著性变化(见图5)。

图2 脱蜡处理后热农1号杧果果实表皮结构变化

图3 脱蜡处理后汤米06杧果果实表皮结构变化

图4 脱蜡处理后椰香杧果果实表皮结构变化

图5 脱蜡处理后红象牙杧果果实表皮结构变化

说明蓝丁胶粘连脱蜡处理可对杧果果实表皮蜡质晶体结构造成一定破坏,从而导致大部分供试杧果品种果实更易受到炭疽菌浸染,发病速度更快,发病程度更严重,也证明杧果果皮蜡质在炭疽菌浸染过程中发挥了一定的物理阻碍作用。

3 讨论与结论

杧果抗性研究中,多采用菌块刺伤和孢子悬浮液喷雾接种法[3,18,19]。菌块刺伤接种会对杧果果实表面造成损伤,不能较好地反映表面蜡质和抗病的关系;不定量的喷雾接种重复性稍差。本实验采用孢子悬浮液无伤定量接种,弥补了前两种方法的不足,可以更好地验证果实表皮蜡质结构在杧果抗病过程中的作用。

表面蜡质提取的主要方法包括有机溶剂溶解和黏合剂粘连两种[20]。有机溶剂主要通过三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇等有机溶剂溶解植物蜡质成分,溶解速度快、操作简单,但该方法无法区分内外蜡质,对果实的损伤较大。黏合剂法主要使用蓝丁胶、阿拉伯树胶等,可以区分内外蜡质,但该方法无法完全去除蜡质。考虑到有机溶剂使用对果实损伤程度较大,且氯仿等有机溶剂的残留可能对真菌的生长发育产生影响,本试验选择蓝丁胶粘连脱蜡法处理杧果。为减小不同操作者的脱蜡处理误差,我们通过预试验规范制订粘连杧果果皮蜡质处理方法,以确保不同品种杧果果皮脱蜡处理一致。

试验结果表明,脱蜡处理前后鹰嘴、红凯特、台牙、贵妃、桂热杧82号等5个杧果品种接种6 d病斑直径无显著性差异,且发病率均未达到100%,推测这些品种果实表皮蜡质较难破坏,是否属于耐贮运品种,有待进一步验证。植物抵抗病原菌侵染是一个复杂的过程。研究发现,苹果梨果皮蜡质能够抑制Alternariaalternata分生孢子萌发和侵染菌丝形成[21],而不同植物的蜡质成分不同,发挥的作用也不同[22-23]。供试杧果品种的蜡质成分是否为其炭疽病菌抗性显著差异的关键因子,也有待进一步研究。本研究结果表明,供试杧果品种的果皮蜡质结构在炭疽菌浸染过程中发挥了一定的物理阻碍作用。这为杧果抗炭疽病机制研究及选育优良抗病品种提供了参考。