栅藻Desmodesmus sp. SNN1 处理生活污水及油脂积累研究

王洪波王鹏冲牛旭东杨文龙陈高

(1.山东建筑大学市政与环境工程学院，山东 济南 250101；2.山东省农业科学院农作物种质资源研究所，山东 济南 250100；3.山东省作物遗传改良与生理生态重点实验室，山东 济南 250100)

0 引言

目前，我国城镇污废水处理工艺主要为活性污泥法。 为达到较好的污水处理效果，针对不同污染物种类，需要结合较为复杂的处理工艺，这些处理工艺均存在设备占地面积大、运行费用高、过程管理复杂等缺点[1]。 污水处理过程中产生的剩余污泥的管理一直是水处理领域中的难题[2-3]，剩余污泥的处置费用也是水厂运行成本之一[4]。 我国生活污水处理主要采用一级污水处理作为预处理，二级污水处理作为主体的方式。 虽然经过二级处理，污水中的污染物有所降低，但是仍然无法有效地降低污水中的无机氮、磷。 经过处理的污水排放到水环境中仍然会造成水体中的氮、磷升高，从而引发水华、赤潮等危害。 因此，开发符合社会经济和环境要求的友好水处理技术迫在眉睫。

微藻废水处理技术是一种极具发展前景的废水处理和养分回收技术，近年来受到广泛关注。 目前，微藻已经在不同废水的处理上取得了一定的成效，如工业废水、市政废水、农业废水及畜牧养殖废水等。 赵秀侠等[5]选取小球藻、栅藻和螺旋藻处理龟鳖养殖废水，发现栅藻对养殖废水的总氮(Total Nitrogen，TN)的去除率为93.65%，小球藻对总磷(Total Phosphorus，TP)的最大去除率为99.46%，而螺旋藻去除氨氮(-N)效果最好，去除率可达98.79%。 郝凯旋等[6]研究了菌藻系统、混合藻、活性污泥对二级出水中氮磷的去除，发现菌藻系统中菌株和微藻之间的协同作用在废水处理方面有较强优势，其对-N、P 的去除率分别为94.16%和83.30%。

污水处理过程中获取的微藻细胞用途十分广泛。 微藻细胞中含有油脂、蛋白质、糖类等，均可以作为化工、饲料、食品的原料。 微藻油脂产率高，是解决油脂来源的重要突破口，可认为是有潜力完全取代石油的生物质资源[7-8]，而且由于微藻具有较高的光合作用效率，成为有竞争力的生物柴油来源。生物柴油是一种可生物降解、可再生、无毒和CO2中性的能源[9]，具有与常规柴油燃料相似的特性[10]；但与常规柴油相比，生物柴油排放的CO、SO2或其他空气污染物更少[9]。 大力发展生物柴油对经济可持续发展、减轻环境压力、控制城市空气污染有着重要的战略意义[11]。

优化栅藻SNN1 在生活污水中的培养条件，可以提高其生物质积累能力和去除化学需氧量(Chemical Oxygen Demand，COD)、-N、TN 和TP等营养物质的能力。 文章将微藻的生产和污水的净化处理结合起来，既可培养微藻快速生长繁殖，又能吸收利用生活污水中的营养物质，为城市生活污水的处理与微藻的生物质生产提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

目标藻种栅藻Desmodesmussp. SNN1 是从山东建筑大学映雪湖湖泥中分离纯化得到的。 生活污水来自山东建筑大学中水站初沉池进水，用于微藻的培养。 收集的污水仅通过定性滤纸抽滤，以去除较大的、不可溶的悬浮固体。 滤液不经高压灭菌、减毒等其他处理直接投入使用。 原污水水质指标:COD为120 ～140 mg/L，-N 为80 ～90 mg/L，TN 为90～100 mg/L，TP 为3～5 mg/L，pH 为7.6～7.8。

1.2 培养条件

微藻的扩大培养均在BG-11 培养基中进行。特定接种量的藻株接种于装有50 mL 生活污水的锥形瓶中培养。 光照培养箱中培养温度为25 ～30 ℃，经24 h 通气，并经光照培养12 d。 实验光照强度为40 μmol/(m2·s)，每天定时摇晃藻瓶3 次。

1.3 实验方法

1.3.1 生活污水初始pH 对处理效果的影响

生活污水初始pH 分别设置为6.0、7.0、8.0、9.0、空白对照组(原污水，pH＝7.8)。 向生活污水中添加一定量的1 mol/L 盐酸和NaOH 溶液调节生活污水的pH，使用pH 计测量生活污水的pH。 每组实验设置2 个平行样。 初始藻液在680 nm 波长处的光密度(Optical Density at 680 nm，OD680)为0.2。 将藻株培养到不同pH 的生活污水中。 每两天取一次样，用于测定-N、COD、生物量、油脂比例和油脂产量。

1.3.2 不同起始接种量对微藻处理生活污水效果的影响

微藻以不同的初始OD680值接种于处理后的生活污水中，根据其生长情况及污水的处理情况，筛选出最合适的初始OD 值。 起始OD680值为0.1、0.2、0.4、0.6，每个OD 值设置2 个平行样。 生活污水初始pH ＝9。 每两天取一次样，用于测定-N、生物量、COD、油脂比例和油脂产量。

1.4 分析方法

1.4.1 水质指标的测定

取样时将样品置于50 mL 离心管中，7 000 r/min离心10 min，上清液经0.45 mm 孔径滤膜抽滤去除藻细胞，滤液用于污水水质指标的测定。 测定方法参照中国国家标准监测方法[12]，其中TN、-N、TP、COD 分别采用过硫酸钾消解紫外分光光度法、纳氏试剂分光光度法、过硫酸钾消解钼酸铵比色法、重铬酸钾法测定。 TN、-N、TP 和COD 去除率的计算由式(1)表示为

式中R为去除率，%；C0、Ct分别为初始、t时刻的质量浓度，mg/L。

1.4.2 生物质指标的测定

(1) 生物量

采用测量微藻细胞干重来测定污水中微藻生物量。 藻细胞干重测量方法:用烘干后的2 mL 离心管装2 mL 待测藻液，12 000 r/min 离心10 min，弃去上清液，放入60 ℃烘箱，烘干至恒重并称重，干重由式(2)表示为

式中M为微藻干重，g/L；m1为烘干前离心管的质量，g；m0为烘干后离心管以及藻的质量，g；V为测量干重所用的藻液体积，L。

(2) 油脂

采用改进氯仿-甲醇法[13]进行测定，每天相同时间取30 mL 藻液于50 mL 离心管中。 将离心管放入离心机中，以7 000 r/min 离心10 min，离心结束后快速倒掉上清液，得到提取油脂藻泥。 加入500 μL的1 mol/L 盐酸，在涡漩振荡器上振荡摇匀，对微藻进行破壁处理，随后在通风橱中加入氯仿和甲醇(体积比2∶1)萃取溶液提取油脂。 将离心管避光置于摇床上，以150 r/min 的速度进行4 h 的振荡反应，使之充分混合。 离心后向试管中加入10 mL生理盐水，于涡漩振荡器上振荡60 s 后，再以7 000 r/min转速离心10 min。 离心后在通风橱内用注射器将最下层氯仿、甲醇和油脂的混合溶液抽取至烘干后的锡纸盒中，并将锡纸盒放入通风橱中直至氯仿、甲醇全部挥发，再将锡纸盒放入60 ℃烘箱中，烘至恒重。

油脂产量由式(3)和(4)分别表示为

式中C为油脂产量，g/L；M0为烘干后锡纸盒的质量，g；M1为烘干后锡纸盒以及油脂质量，g；η为油脂比例，%。

2 结果与分析

2.1 初始pH 对栅藻SNN1 处理生活污水及生物质积累的影响

2.1.1 初始pH 对栅藻SNN1 处理生活污水的影响

不同初始pH 对栅藻SNN1 处理生活污水效果的影响如图1 所示。 栅藻SNN1 对不同初始pH 生活污水中COD 的去除效果如图1(a)所示。 在0 ～4 d时，不同初始pH 的生活污水中COD 有一定程度的下降；在4～12 d 时，COD 基本保持稳定。 随着初始pH 的升高，栅藻SNN1 对生活污水中COD 的去除效果也在逐渐增强。 pH ＝6.0 时，生活污水中的COD 由137.27 mg/L 降至87.16 mg/L；pH ＝9.0 时，COD 降至72.85 mg/L，去除率高达46.93%，高于其他实验组。 造成这种情况的原因可能是栅藻SNN1在较高的pH 中会有较好的生物活性，代谢能力更强，会去除较多的COD；在较低的pH 中代谢活动减弱，生长能力差，去除量减少。 但COD 的脱除效率依然较低，是因为生活污水中的有机物主要是纤维素、有机酸等难降解大分子物质，微藻对其同化降解能力较低、速度较慢[14]。 栅藻SNN1 对不同pH 生活污水中氮的去除效果如图1(b)和(c)所示。 由图1(b)可知，除pH ＝6.0 的实验组外，在处理末期，生活污水中的-N 基本可以去除。 由图1(c)可知，除pH＝6.0 的实验组外，在实验末期，其他实验组的TN 都能降到较低的水平。 当pH ＝9.0时，TN 由97.25 mg/L降至2.92 mg/L，去除率最高可达97.00%；当pH＝6.0 时，TN 降至31.62 mg/L，去除率最低仅为67.48%。 这与许海等[15]得出的斜生栅藻适宜在高pH 条件下生长的结论相符。 栅藻SNN1 对不同pH生活污水中P 的去除效果如图1(d)所示。 经过12 d的处理，在不同pH 的生活污水中栅藻SNN1 对TP去除率基本都能＞95%。 栅藻SNN1 在较短的时间内能将TP 降到比较低的水平。

图1 不同初始pH 对栅藻SNN1 处理生活污水效果影响图

有研究[15]表明，pH 主要通过影响藻类生长来影响脱氮除磷作用，表现在:(1) 藻细胞只能在适当的酸碱度范围内正常发育增殖，酸性或碱性过强均会对藻类细胞产生破坏；(2) pH 能干扰碳酸盐平衡体系与各种形态的无机碳分配关系，进而干扰藻细胞发育。 综上所述，栅藻SNN1 在初始pH ＝9.0 的情况下，对生活污水中COD、-N、TN 和TP 的去除率均达到最高。

2.1.2 初始pH 对栅藻SNN1 生物质积累的影响

pH 不仅可通过引起细胞膜电荷变化和影响营养物离子化程度来影响微生物对营养物的吸收，而且还影响细胞中各种酶的活性。 初始pH 对栅藻SNN1 生物质影响如图2 所示。 低pH 会对栅藻SNN1 的生长产生抑制作用，按栅藻SNN1 的生物量由高到低，各pH 实验组顺序为9.0 ＞空白对照组＞8.0＞7.0＞6.0。 空白对照组的生物量高于pH ＝8.0组，可能是实验误差所致。 在pH ＝9.0 时，最大生物量达到1.08 g/L。 随着pH 降低，微藻生物量逐渐下降，当pH＝6.0 时，生物量仅为0.31 g/L，相对于pH ＝9.0 时下降了71.3%。

图2 栅藻SNN1 在不同初始pH 生活污水中的生物量情况图

不同初始pH 的生活污水中，栅藻SNN1 的油脂生产情况如图3 所示。 初始pH 为7.0 ～9.0，栅藻SNN1 的油脂比例和油脂产量随pH 升高而增加，初始pH＝9.0 时，油脂比例和油脂产量的最大值分别为24.72%和267.00 mg/L。 随着pH 的降低，油脂产量明显下降，但在生活污水初始pH ＝6.0 条件下，栅藻SNN1 的油脂最高为33.76%。 这与王秀良等[16]报道的微绿球藻在pH ＝6.8 的时候总脂比例与脂肪酸比例最高基本相符。 由此可见，偏酸性条件更有利于栅藻SNN1 油脂的积累，但是由于其生物量不足，油脂产量大大降低，均低于其他实验组。 因此，确定栅藻SNN1 生产油脂的最适初始pH 为9.0。

图3 栅藻SNN1 在不同初始pH 生活污水中油脂比例及油脂产量图

2.2 不同初始接种量对栅藻SNN1 处理污水及生物质积累的影响

2.2.1 不同初始接种量对栅藻SNN1 处理生活污水的影响

调节生活污水初始pH ＝9.0，起始OD680值为0.1、0.2、0.4 和0.6。 不同初始接种量下栅藻SNN1对生活污水中污染物去除情况如图4 所示。 图4(a)为不同初始接种量下栅藻SNN1 对污水中COD的去除情况。在加大接种量的情况下，能够增加COD 的去除效率。 在培养初期的4 d 内，各个实验组污水中的COD 下降速度较快，之后COD 基本趋于平稳。 在实验末期，接种量OD680分别为0.4、0.6的实验组较其他两组去除效果好，对COD 的去除率基本相同，分别为47.70%和47.98%，高于其他两组。 不同初始接种量下栅藻SNN1 对污水中-N 的去除情况如图4(b)所示。 4 个不同接种量下，-N 随着培养时间的增加逐渐下降，在培养6 d 后，最终4 个实验组中-N 稳定于较低水平。 到实验后期水中的-N 基本可以去除，去除率均＞95%。 图4(c)为不同初始接种量下栅藻SNN1 对生活污水中TN 处理情况。 随着接种量的提高，栅藻SNN1 对生活污水中TN 的去除率随之上升，在初始OD680为0.6的条件下，去除效果最为显著，从最初的96.48 mg/L下降到2.62 mg/L，去除率为97.29%。 不同初始接种量下栅藻SNN1 去除生活污水中TP 的情况如图4(d)所示。 与TN 有所不同，生活污水中P 较低，栅藻SNN1 在处理12 d 后，在不同初始接种量下，TP 基本上都有＞95%的去除率。 综上所述，综合考虑接种量OD680＝0.6 是栅藻SNN1 处理生活污水的最佳接种量。

图4 不同初始接种量下栅藻SNN1 对生活污水中污染物的去除情况图

2.2.2 不同初始接种量对栅藻SNN1 生物质积累的影响

微藻的初始密度可以改变微藻生长微环境(照度、营养、空间、胁迫及分泌物积累等[17-18])。 接种密度也是影响微藻生产性培养时增殖速率和采收生物量的重要因素[19-20]。 对比初始接种量OD680为0.1、0.2、0.4、0.6 的生物量变化(如图5 所示)，可以看出接种初期生长较快，在生长后期逐步进入平稳阶段。 在初始OD680为0.6 的条件下，栅藻SNN1 的生物质产量培养12 d 后达到最高的1.34 g/L，为各个实验组最高。 初始OD680为0.2 和0.4 的实验组略有优势，生物量为1.08、1.13 g/L。 而初始接种量为0.1 时，废水生长情况相对较差，最终生物量为0.98 g/L。 造成这样的原因是初始OD680为0.6 组的藻液质量浓度高，对生活污水的适应性较好，对营养物质的吸收速率高，将污水中的大部分营养物质加以利用，因而在前期生长较快。 在实验后期，初始OD680为0.6 组的生物量略有下降，原因可能是:藻液质量浓度高降低了透光率，在实验后期影响了栅藻SNN1 的生长；实验后期生活污水中营养物质减少也限制其生长。

图5 不同初始接种量下栅藻SNN1 的生物量情况图

不同初始接种量下，栅藻SNN1 的油脂生产情况如图6 所示。 栅藻SNN1 的油脂比例和油脂产量随着初始接种量的提高逐步下降。初始接种量OD680为0.6 时，藻株油脂比例和油脂产量分别为18.94%、250.33 mg/L。 油脂比例为4 个实验组最低，而油脂产量略高于初始OD680为0.4 的实验组(245.00 mg/L)。 初始接种密度过大，导致微藻生长后期营养供给不足，进入衰亡期，微藻细胞进行内源物质的消耗，从而导致较低的油脂产量和油脂比例。而初始接种量OD680＝0.1 时，藻株油脂比例和油脂产量分别为29.54%、291.33 mg/L，均高于其他实验组。 由此可知，在此初始接种量下，藻种可获得相当的油脂产量和油脂比例。 因此选择初始接种量OD680＝0.1 为栅藻SNN1 培养产油的最佳值。

图6 不同初始接种量下栅藻SNN1 油脂比例及油脂产量图

综上所述，栅藻SNN1 处理生活污水和生物量积累的最佳培养条件为生活污水初始pH ＝9.0、初始接种量OD680＝0.6。 生产油脂的最佳培养条件为初始pH＝9.0、初始接种量OD680＝0.1。 培养条件优化前后栅藻SNN1 对生活污水污染物质的去除率、生物量积累及产油情况见表1。 经过优化培养后，栅藻SNN1 对生活污水污染物去除率都有一定的提升，其中COD 最为明显，去除率提高了17.30%，获得的生物量、油脂比例和油脂产量分别是优化前的1.28、1.29 和1.21 倍。 优化后对生活污水水质净化效果和微藻生物质积累都有显著提高。

表1 栅藻SNN1 培养条件优化前后生活污水处理及生物质积累情况表

3 讨论

不同藻株生长的最适pH 不同，当偏离最适pH时，藻株生长和体内的代谢活动会受到抑制。 pH 的变化会影响微藻细胞在光合作用中酶的活性，影响微藻生物量的积累[21]。 KHALIL 等[22]以NaOH/盐酸溶液控制培养液的pH，研究了不同pH(4、6、7.5、8、9、10、11)对椭圆形小球藻生长的影响，表明小球藻可以在较宽的pH 范围(4 ～10)内生长，在碱性条件下(pH 为9.0 ～10.0)获得了最大生物质产量，在pH 为10 ～11 时生物质产量有所下降。 MARCEKCHORVATOVA 等[23]研究表明，大多数藻类在pH为7～9 的范围生长繁殖，最佳pH 为8.2 ～8.7，中性或pH 较低的水会降低藻类的生长活性。 文章研究表明，随着生活污水初始pH 的升高，栅藻SNN1 对生活污水中营养物质处理效果与自身生物量的积累也逐渐增强。 pH＝9.0 的条件对生活污水中营养物质的去除效果最好，自身生物量也达到最大值。 由此可推知，栅藻SNN1 喜好偏碱性环境，且初始pH为9.0 的条件下更适宜生长，是微藻处理生活污水的最适pH。

微藻的初始接种量会影响其在不同时间内的生物量以及对营养物质的去除:初始接种量太低，则初始生长速率较慢，对污染物的去除效率降低；接种量过高，微藻虽可较快进入指数生长期，但过多的藻会让藻细胞间相互遮光，光合作用效率降低，影响微藻生长和叶绿素合成[24]，大规模培养时会造成藻株成本过高，也不利营养物质的去除。 萧铭明[25]研究发现当接种量为50%时，在酒精废水中培养的钝顶螺旋藻干重平均值最高；而接种量为30%时叶绿素a平均值最高。 项荩仪[26]的研究表明当用小球藻处理市政污水时，接种OD680为1.2 时小球藻脱氮除磷的效果较好。 在文章研究中，当初始接种量为0.6时，栅藻SNN1 对生活污水中COD、TN 去除效果较好，生物量的积累也达到最高。 因此，接种量为0.6时，栅藻SNN1 即可有效去除生活污水中的营养物质，又能达到较高生物量的积累。

经过优化实验条件，栅藻SNN1 生产油脂的最佳培养条件为:生活污水初始pH ＝9.0、微藻初始接种量OD680＝9.0。 在此条件下培养12 d，藻株油脂比例和油脂产量分别为29.54%、291.33 mg/L。 油脂比例、油脂产率分别是优化前的1.29 和1.21 倍，说明栅藻SNN1 具有一定的产油潜力，在后续实验中可进一步探究。

4 结论

经过上述研究，得到以下结论:

(1) 以实验室前期分离的栅藻Desmodesmussp.SNN1 为目标藻株，优化其在生活污水中的培养条件，处理生活污水最佳条件为污水初始pH ＝9.0、微藻初始接种量OD680＝0.6。 在此条件下培养12 d后，污水的COD、-N、TN 和TP 的去除率分别为47.98%、99.93%、97.29%和97.13%，最终生物量可达1.34 g/L。

(2) 微藻生产油脂的最佳培养条件为初始pH ＝9.0，初始接种量OD680＝0.1。 在优化条件下培养12 d后， 油脂比例和油脂产量分别为29. 54%、291.33 mg/L。 去除效果与生物质产量较未优化时有了进一步的提高。