液相色谱-串联质谱法快速检测刺参中硝基呋喃类代谢物方法

刘 峰，孙远远，安 萍，张守峰，史德杰

(日照市海洋与渔业研究院，山东 日照 276800)

硝基呋喃类药物是一种人工合成的具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗生素，常见有呋喃唑酮(FZD)、呋喃西林(NFZ)、呋喃妥因(NFT)和呋喃它酮(FTD)。经研究发现，该类药物在动物体内快速分解产生的代谢物可与动物体内蛋白质结合而长时间稳定存在，对人体产生“三致”潜在危害(肖曼等，2020)。随着刺参大规模人工养殖的发展，粗放的养殖管理以及高密度养殖等原因导致病害等问题接踵而至。养殖者为控制疾病发生，使用抗生素等化学药物进行预防和治疗。尽管硝基呋喃类药物已被列为水产禁用药，但通过目前对刺参进行的多次质量安全检查发现，硝基呋喃类代谢物在刺参苗种和市售产品中仍偶有检出，人们更加重视刺参产品质量安全问题。

本文采用液相色谱-串联质谱法来测定刺参产品中硝基呋喃类代谢物，通过优化衍生温度、衍生时间以及衍生试剂含量，缩短前处理过程，建立了刺参中硝基呋喃类代谢物快速检测方法，以期为开展刺参产品质量安全监管提供科学的数据支持，从而推动刺参养殖业的健康发展，保障消费者身体健康。

一、材料与方法

1.仪器与设备

超高效液相色谱-质谱联用仪(Agilent 1260/6460A)、电子分析天平、涡旋混合器、电热恒温培养箱、台式高速离心机、水浴氮吹仪、超声仪、固相萃取装置、可调式移液器、量筒、容量瓶等。

2.试剂配制

0.2摩尔/升盐酸溶液：取盐酸4毫升，用水稀释至200毫升，混匀。

0.05摩尔/升2-硝基苯甲醛溶液：取2-硝基苯甲醛0.052 9 克，溶解于7 毫升二甲亚砜中，混匀，现用现配。

1.0摩尔/升磷酸氢二钾溶液：取三水合磷酸氢二钾45.6 克，用水溶解并稀释至200 毫升，混匀。

0.002摩尔/升乙酸铵溶液：取乙酸铵0.045 克，加300 微升甲酸，用水溶解并稀释至300毫升，超声去气泡，现配现用。

甲醇溶液：200毫升甲醇中加200微升甲酸。

定容液：甲醇溶液∶乙酸铵溶液＝1∶4。

100纳克/毫升4种硝基呋喃类代谢物的混合标准工作液：准确吸取100 微克/毫升4 种硝基呋喃类代谢物混合标准溶液50 微升于50 毫升容量瓶中，用超纯水定容配制成100 纳克/毫升4 种硝基呋喃类代谢物的混合标准工作液，贮存于棕色试剂瓶中，2～8℃下冷藏保存，有效期1个月。

10 纳克/毫升4 种硝基呋喃类代谢物的混合标准工作液：准确吸取100 纳克/毫升的4 种硝基呋喃类代谢物混合标准工作液5 毫升于50 毫升容量瓶中，用超纯水定容配制成10纳克/毫升的混合标准工作液，贮存于棕色试剂瓶中，2～8℃下冷藏保存，有效期1个月。

100纳克/毫升4种硝基呋喃类代谢物的内标混合溶液：准确吸取100 微克/毫升4 种硝基呋喃类代谢物内标混合溶液50 微升于50 毫升容量瓶中，用超纯水定容配制成100 纳克/毫升4 种硝基呋喃类代谢物内标混合溶液，贮存于棕色试剂瓶中，2～8℃下冷藏保存，有效期1个月。

3.方法

(1)实验条件优化。本实验共设置5 个优化条件(第1～5 组)，以37℃下避光震荡16 小时(第6组)为对照，见表1。

表1 实验条件优化设置

(2)测定步骤。向2.00克刺参阴性样品中准确加入50 微升内标混合溶液(100 纳克/毫升)、5 毫升盐酸溶液(0.2 摩尔/升)和相应体积的衍生化试剂(0.05摩尔/升)，涡旋混合50秒，按表1所列条件于电热恒温培养箱中衍生。衍生结束后取出冷却至室温，加入5 毫升磷酸氢二钾(1.0 摩尔/升)、6 毫升乙酸乙酯，涡旋振荡2 分钟，4 000 转/分离心5 分钟后，提取上清液至10 毫升离心管中，在60℃水浴氮吹仪中吹干。加入1毫升定容液，涡旋振荡溶解残留物，再加入3毫升正己烷，涡旋混合1 分钟，于7 000 转/分下离心8 分钟，提取净化去除油脂，弃去上层有机相后，吸取下层溶液，经0.45 微米滤膜过滤，上机测定。按相同方法测定2.5微克/千克质控样回收率和0.25微克/千克检出限信噪比。

(3)标准曲线制作。用移液枪依次吸取10 纳克/毫升标准工作液50、100 微升和100 纳克/毫升标准工作液25、50、100、200 微升进行测定，制成浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0纳克/毫升的标准工作曲线。

(4)上机条件。色谱柱为C18 柱，柱温31℃，进样量为20 微升，流动相A 相为0.002 摩尔/升乙酸铵溶液，B 相为甲醇溶液，洗脱程序见表2。离子化模式为大气压电喷雾离子源正离子模式。

表2 流动相洗脱程序

(5)判定依据。当实验组检测结果满足《农业农村部783号公告》要求，即实验组与对照组保留时间相对标准偏差在5%以内、离子丰度比相对标准偏差≤20%、回收率在80%～110%以内、0.25 微克/千克检出限信噪比≥10时，判定该方法可行。

二、结果

各优化条件的检测结果见表3。结果表明，除70℃下衍生0.5 小时(4 组)的检出限未出现目标峰、不符合检测要求外，其他优化条件均能找到目标峰，且保留时间相对偏差≤5%、线性回归R2≥0.995、80%≤加标回收率≤110%、检出限信噪比≥10，均满足检测要求，可作为硝基呋喃代谢物快速检测方法，其中以加入150 微升衍生化试剂在60℃下衍生1小时的衍生条件为最佳，在保证检测结果可靠性的同时最大限度缩短了衍生时间，更加节能环保。

表3 不同优化条件下检测情况

三、讨论

目前硝基呋喃类代谢物快速检测方法以快检试剂盒检测为主，该方法只对药物残留进行定性分析，无法给出准确的残留量，4 种物质单独检测，不仅费时费力，而且检测过程中使用的一次性实验耗材容易造成环境污染，不利于资源节约。本文通过优化设置5种衍生条件，最终构建了60℃下衍生1小时这一最佳快速检测方法，不仅可以同时对水产品中4种硝基呋喃类代谢物残留进行快速准确地定性和定量分析，大大提高检测效率，而且节省实验耗材，达到节能环保目的。该方法可为开展刺参产品质量安全风险评估和实施科学监管提供科学的数据支持，进而推动刺参养殖业健康发展，保障消费者身体健康。

通常硝基呋喃类代谢物在用乙酸乙酯提取时采用4 000 转/分离心，氮吹后用正己烷去脂时采用7 000 转/分离心，但部分水产品脂肪水平较高，在此速率下离心易出现乳化现象，难以分层，因此在实际操作中常通过提高转速来实现分离(任召珍等，2019)。而本实验发现，由于刺参属于高蛋白质、低脂肪、营养品质上乘的优质参，粗脂肪水平较低，在用乙酸乙酯提取时采用4 000转/分离心5 分钟、氮吹后用正己烷去脂时采用7 000 转/分离心8 分钟，即可取得较好的分离效果，无须再增加转速。此外，现行标准中检测水产品中硝基呋喃类代谢物时均规定用乙酸乙酯提取2次，本文通过实验发现，硝基呋喃类药物采用内标定量法，结果较稳定，一次性加6毫升乙酸乙酯提取1次，硝基呋喃类药物的回收率和相对标准偏差均在要求范围内。因此，采用一次提取法既可满足检测要求，又可提高检测效率，同时减少了试剂使用量，可推广应用于刺参中硝基呋喃类代谢物的快速检测。